本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种淡水中毒力基因为Stx1的大肠杆菌的快速筛选方法。
背景技术：
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，为埃希氏菌属的代表菌种，广泛存在于自然界中，其中致病性大肠杆菌(比如肠出血性大肠杆菌EHEC)能释放强烈的毒素，并可能导致人和动物出现严重症状，如带血腹泻。世界各国及国际组织都将大肠杆菌作为重要卫生与环境安全指标：世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定,所有用于饮用的水中大肠杆菌不得检出；美国饮用水标准规定，一级水质中大肠杆菌不得检出；中国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》也规定,总大肠菌群及粪大肠菌群不得检出。
目前,国际上公认的大肠杆菌标准检测方法以多管发酵法和滤膜法为主，即先根据其培养特性生物学特性进行初步鉴定，然后根据生化试验进行最终的确诊。上述方法检测周期长,操作繁琐,难以适应污染源快速诊断的需要。近年来,基于核酸技术的分子生物学方法得到了快速发展。由于研究结果表明，肠出血性大肠杆菌携带的主要毒力基因为Stx1和Stx2(Ojo,O.E.,Ajuwape,A.T.P.,Otesile,E.B.,Owoade,A.A.,Oyekunle,M.A.,Adetosoye,A.I.Potentially zoonotic shiga toxin-producing escherichia coli serogroups in the faeces and meat of food-producing animals in ibadan,nigeria.International Journal of Food Microbiology，2010，142，214-221)，许多以其为识别位点的PCR方法(Khatami,F.,Heidari,M.,Khatami,M.Rapid detection of Escherichia coli O157∶H7 by fluorescent amplification-based specific hybridization(FLASH)PCR.Iranian Red CrescentMedical Journal,2012,14,594-598；Son,I.,Binet,R.,Maounounen,L.A.Detection of five Shiga toxinproducingEscherichia coli genes with multiplex PCR.FoodMicrobiology,2014,40,31-40)和环介导等温基因扩增方法(Wang,F.,Yang,Q.,Qu,Y.,Meng,J,Ge B.Evaluation of a loop-mediatedisothermal amplification suite for the rapid,reliable,androbust detection of Shiga toxin-producing Escherichia coliinproduce.Applied and Environmental Microbiology,2014,80,2516-2525；Wu,L.,Song,Y.,Luan,T.,Ma,L.,Su,L.,Wang,S.,Yan,X.Specific detection of liveEscherichia coliO157:H7using tetracysteinetagged PP01 bacteriophage.Biosensors and Bioelectronics,2016,86,102-108)已经建立和应用。较之于传统方法，基于核酸扩增的分子生物学方法检测更为快速、灵敏、简单。然而，目前基于核酸扩增的分子生物学方法全部基于目标细菌的DNA提取，必需离心机等贵重辅助仪器，因而无法实施野外现场测定。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提供一种淡水中毒力基因为Stx1的大肠杆菌的快速筛选方法，所述方法工作原理为：调节水样酸度，使游离DNA吸附富集在功能膜上，然后采用环介导等温基因扩增技术鉴定Stx1基因的定性信息，从而实现快速筛选出阳性淡水样品。
本发明是通过以下步骤来实现：
一种淡水中毒力基因为Stx1的大肠杆菌的快速筛选方法，步骤包括样品收集、预过滤、富集游离DNA、清洗和环介导等温基因扩增鉴定五个步骤。
进一步，所述的样品收集步骤，指原位收集不少于1.0L的待测定淡水；
进一步，所述的预过滤步骤，采用水系微孔滤膜过滤所收集的淡水样品，除去不溶性物质；
进一步，所述的水系微孔滤膜孔径为0.45μm；
进一步，所述的富集游离DNA步骤，首先向过滤后的样品中加入HCl或H2SO4，调节pH至4.9～5.8，再采用硅胶膜过滤，富集游离DNA到膜上。
进一步，所述的清洗步骤是在样品完全过滤后，再加上纯水，洗去干扰小分子和离子。
进一步，所述的环介导等温基因扩增步骤，首先将硅胶膜平均分成4份，每份装入一个反应管，然后加入包括引物、酶在内的扩增反应试剂和指示剂，封闭反应管，放入61-65°放温度下反应；同时做阳性和阴性对照，指示剂颜色变化指示环介导等温基因扩增结果，阳性结果说明所测定淡水样品中有目标基因，即表明毒力基因为Stx1的大肠杆菌具有存在可能性。
进一步，所述的反应管是透明的玻璃管、有机玻璃管或塑料管；
进一步，所述的指示剂为钙黄绿素或羟基萘酚蓝；
进一步，所述的各步骤，均采用无菌、无DNA污染的洁净器具。
本发明与现有技术对比的有益效果：
(1)本发明首次发现淡水样品里游离DNA中Stx1基因与肠出血性大肠杆菌存在对应关系。本筛选方法直接采集样品中游离DNA，无需增菌及DNA提取步骤，因而高效、快捷。
(2)无需贵重设备，操作简易，成本低，且可以实施现场测定。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的内容作进一步的解释。但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1筛查自来水中是否含有毒力基因为Stx1的大肠杆菌
步骤一、灭菌、清洗所有需要的器具，使用前密封保存。
步骤二、用量筒接取自来水1.0L，采用注射器和针筒式滤膜过滤器(天津津腾，0.45μm水系微孔滤膜)滤除不溶物，收集滤液到洁净烧杯中。
步骤三、向烧杯中滴入1滴0.1mol/L的HCl，微晃动混匀，调节pH至4.9～5.8。
步骤四、将核酸吸附硅胶膜(Lifefeng，杭州莱枫生物科技有限公司)放在过滤器(T-50，天津津腾)的砂心过滤头上，固定好滤杯。
步骤五、将上述酸化的滤液倒入滤杯，重力作用下过滤，然后加入上0.2L纯水，直至滤杯内溶液全部消失。
步骤六、取出硅胶膜，剪成均分4份，分别塞入一个1.5ml PCR管。
步骤七、向PCR管中加入环介导等温基因扩增试剂，250μL的反应体系包括各1.6μmol/L的引物FIP和BIP，各0.8μmol/L的引物LF和LB，各0.2μmol/L的引物F3和B3，1.4mmol/L的dNTPs，6.0mmol/L的MgSO4，0.12μmol/L的羟基萘酚蓝，1×缓冲液，8U/L的Bst大片段DNA聚合酶(美国NEB公司)。其中引物序列分别为(5’-3’)
F3：TGTTGGAAGAATTTCTTTTGGA；
B3：GCTAATAGCCCTGCGTATC；
FIP：CGCGATGCATGATGATGACAATAGTGTTAATGCAATTCTGGGT；
BIP：GAGCTTCCTTCTATGTGCCCGCAGAGTGGATGAGTCCCA；
LF：TCGCACCGTAATTATGACT；
LB：AGATGGAAGAGTGCGTGGG。
同时做阳性对照和阴性对照各1个。阳性对照实验以肠出血性大肠杆菌基因组DNA为模板；阴性对照以纯水为模板。
步骤八、将上述6个反应管置于65℃水浴中反应60min。
步骤九、结果判断：检测管中紫色混合液变为天蓝色，表明待测自来水可能被毒力基因为Stx1的大肠杆菌污染；未变色，表明阴性。如对照管出现不符合情况，查找原因，消除影响因素，重做实验。