一种检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种试剂盒，尤其涉及一种检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒及其应用。
背景技术：
：海豚链球菌(Streptococcusiniae)病是一种重要的鱼类细菌病，常在罗非鱼、鲈鱼等养殖鱼类中引起爆发性鱼病，导致鱼群大量死亡。再者，海豚链球菌还可以通过伤口感染人，已被确立为新型人畜共患病原。目前，国内检测海豚链球菌仍然采用传统的形态学、染色和生化试验进行鉴定，花费时间长，而且灵敏度和特异性都难以满足快速检测和生产上的需要。国际水生动物疾病诊断参考实验室认为，同已有的细菌生化鉴定和免疫学检测方法相比，PCR技术能够解决大多数有关敏感性和特异性的问题，而与普通PCR相比，荧光PCR检测方法的结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染，其在水产疾病诊断领域具有着更加广阔的应用前景。核糖体是细菌唯一的细胞器，是蛋白质合成的场所，它的沉降系数是70S，在适当条件下解离成50S和30S两个大小亚基，两个亚基都含有RNA和蛋白质。rRNA按沉降系数分3种，分别为5S，16S和23S。5S和23SrRNA基因在50S亚基中，16SrRNA在30S亚基中，它们是核糖体不可缺少的成分。16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16SrRNA基因约由1540个核苷酸组成，并含有多个拷贝(即转录单位)，如大肠杆菌K12染色体基因组中，含7个16SrRNA拷贝，而在一般情况下，细菌的其他结构基因都是单拷贝的。细菌16SrRNA基因序列由保守区和可变区组成，两者互相交错排列。编码rRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。现有细菌的RNA均由其祖先一代一代传下来，虽然在长期的进化过程中，由于不时突变而有较大变化，但其祖先的某些痕迹仍留在其核苷酸序列中，这种痕迹为细菌的系统进化研究提供了可能。因此，有人将rRNA称为细菌的“化石”。这一“化石”的存在，为细菌的研究提供了方便。由于16SrRNA基因核苷酸序列总长度适宜，结构完整，更便于对细菌进行各种研究。设计一对引物，以16SrRNA为靶分子在适当条件下进行PCR扩增，便得到扩增后的16SrRNA片段，用链终止法或化学降解法对片段进行测序，序列与基因库中的片段比对，便得知未知菌与基因库中其他菌的相似性，从而完成对菌的鉴定。当鉴定同源性很高的菌种时，可以用生理生化实验或其他方法作为补充。技术实现要素：本发明的目的是提供一种针对性强、灵敏度高，较于类似试剂盒更加准确的荧光PCR检测试剂盒，用来在鱼类海豚链球菌病高发季节，大批量、快速、准确的鉴定该病。为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒，其中，包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于检测鱼类链球菌的特异性引物和特异性探针，其中：上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3所示。具体地，SEQIDNO:1序列为5’-actatgagatggacctgcgtt-3’，SEQIDNO:2序列为5’-cagtcccagtgtggccgatc-3’，SEQIDNO:3序列为5’-caccaaggcgacgatacatagccga-3’。所述TaqMan探针为经过荧光标记，其5'端标记有报告荧光基团，3'端标记有淬灭荧光基团。引物设计模板SEQIDNO:4出自NCBI数据库Y07622号。所述报告荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC中的一种，优选为ROX；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ中的一种，优选为BHQ。本发明检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒应用在检测所有鱼类海豚链球菌，尤其检测罗非鱼海豚链球菌。本发明检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒使用方法如下:取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准品以及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行荧光定量PCR反应，其中反应液、阳性标准品、阴性标准品中均含有上游引物的序列SEQIDNO:1、下游引物的序列SEQIDNO:2和特异性探针的序列SEQIDNO:3。样本预处理：采集待检鱼的脑、头肾、肝、脾、眼等组织，用细菌DNA提取试剂盒提取核酸作为模板，待用。试剂盒的每一个25μL反应体系组成为：试剂体积模板(50～500ng)2μL10×buffer2.5μL上游引物SEQIDNO:1(10μM)1μL下游引物SEQIDNO:2(10μM)1μL探针引物SEQIDNO:3(10μM)0.5μLdNTPs(2.5mM)2μLDNA聚合酶(5U/μL)1μL双蒸水15μL优选的，所述的荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃10s，55℃30s，72℃10s延伸，5个循环；95℃5s，55℃30s(搜集荧光信号)，40个循环。用ABIV7荧光PCR仪(或同类仪器)分析反应结果。结果判定：阴性对照无Ct值或Ct值≥40，阳性对照Ct值＜40且出现S形扩增曲线，实验成立。样品无Ct值或Ct值≥40，判定为阴性；样品Ct值＜40且出现S形扩增曲线，判定为阳性。荧光PCR结果为阳性、产物序列与SEQIDNO:5给出的参考序列一致，且主要生理生化特性与S.iniae一致，则应判为海豚链球菌感染。本发明检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒具有以下的有益效果：1、经过实验大量的重复比对、多方法比对，本发明所涉及的试剂盒特异性强、灵敏度高。2、重复性良好。本发明建立方法初期采用ATCC29178号菌种，对本试剂盒进行反复验证，所获得的试验结果重复性很好。3、稳定性良好。本试剂盒第一批产品合成于2015年9月，该批试剂盒至今可以正常使用。4、本发明试剂盒定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。5、本发明选取了高度保守的目的基因，使得试剂盒的特异性更强，可以区分同源性极高的相似细菌。6、本发明试剂盒检测灵敏度和特异性高，由于采取特异性引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到海豚链球菌的感染。7、本发明试剂盒检测速度快，总共仅需95分钟左右，步骤简单，可同时进行高通量样本检测。附图说明图1为2015年10月实施的一例鱼类海豚链球菌阳性标准品的荧光PCR扩增曲线和阴性标准品的荧光PCR扩增曲线。图2为2016年7月实施的一例鱼类海豚链球菌临床样本的荧光PCR扩增曲线。图3为2017年1月实施的一例鱼类海豚链球菌阳性标准品的荧光PCR扩增曲线和阴性标准品的荧光PCR扩增曲线。具体实施方式实施例12015年10月，用上游引物SEQIDNO:1、下游引物SEQIDNO:2、探针SEQIDNO:3所组成的反应体系和以MGX基因为目的基因设计的引物SEQIDNO:6、引物SEQIDNO:7、探针SEQIDNO:8所组成的反应体系用ABI7300荧光PCR仪同时进行扩增，按照本试剂盒所采用的反应条件进行试验，结果见图1。由图1可见，在曲线形状、Ct值、荧光信号强度等方面，以MGX为目的基因设计的引物、探针扩增效果均不如以本发明采用的引物、探针的扩增效果，说明本试剂盒灵敏度较好。实施例2在试剂盒放置9个月后，对一例生化鉴定为海豚链球菌的罗非鱼组织样本、海豚链球菌菌种(ATCC29178)、金黄色葡萄球菌菌种(ATCC29213)应用本试剂盒方法进行试验，用ABI7300荧光PCR仪进行扩增，试验结果见图2。由图2可见，本试剂盒在放置一段时间后，反复操作，时间结果依然良好，说明本试剂盒的重复性、特异性均较好。实施例3在试剂盒在-20℃放置15个月后，使用该批试剂盒按照本试剂盒所采用的反应条件进行试验，用ABIV7荧光PCR仪对阳性标准品和阴性标准品进行扩增，试验结果见图3。由图3可见，本试剂盒在-20℃长期保存后，扩增强度略有衰减，但依旧可以正常使用，说明本试剂盒重复性、稳定性均较好。以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。序列表<110>海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>一种检测鱼类海豚链球菌荧光PCR试剂盒及其应用<130>2017<160>8<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15’-actatgagatggacctgcgtt-3’<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>25’-cagtcccagtgtggccgatc-3’<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>35’-caccaaggcgacgatacatagccga-3’<210>4<211>3961<212>DNA<213>海豚链球菌：Y07622IctP&IctO和ORF1基因<400>41aagctttgtcagatccagctagaagagaaatcttgacgcttttgaaggatggtcagatgt61cagcaggtgacattgctgctcgatttgacttagctcaggcttctgtttcatatcatttaa121acattctcaaaaaagcagacttaatcagtgaaacgaaggtcaaaaattttatttattatg181atattaatacctccgttttagaagatattatggcatggctacaagctattaaaggagatt241ctaatcatgaaaattaagaaaaacgtattactcataacaagtctaattgtcttgctacct301attgtcattggtctccttttatggcgacaattgcctgagcaaatagcaacacattttgat361ttttcaggaaaaccagatggctattcaagtaaatttgaagcagtttttttcttgccaggg421gttatgcttttgacacatcttttttgcatttggctaacatcaaaagatccaaaatcagga481ggtcttggcaaaatgcaacatcttatttattggattgttcctgtgatttctatttttgca541cagtcgatggtctttttggtagcctctggctttacgaaaataagtgtttttaatgccaac601ctttttttggggctcttgttcttggttttaggaaattatctacctaaagttagacaaaac661tatactgtagggattaagttaccatggactttaaatgatgagactaactggaacaagact721catcgtcttgctggaaaactttgggtagttggtggtttagccctattcatttttggtttg781tttgggattgaaaatggatcaattattttcatttctttagctgtcatactagtagtgccc841atgatttattcttatcgtttatttaaaaatgataattaaggaaaaaggatttcacaatct901tttaacgatttagctgatgagtaactctgcaaatggtgatttgtagggtctttttaattt961aaactggtaaaattaaaaaaataatcacaagccaaaaaagtgagcattagatttgactaa1021tagattaatgtttattattataaagataatatttgaaagcgctaacaaattataactgtt1081ttcattatataaaaagcgaggttttaaaccatatgtttcaagcaatattagcaatcattc1141caattttgtggttaattttatcgttagccgtt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