一种基于两端锁定DNA酶的分子信标识别miRNA新方法与流程

本发明涉及一种基于两端锁定DNA酶的分子信标识别miRNA新方法，属于生物传感技术领域。

背景技术：

miRNAs在众多疾病(特别是肿瘤疾病)基因调控中扮演着重要角色，其异常表达总是伴随着疾病的产生，通过测定miRNAs表达水平对疾病进行诊断将成为一种很有前景的诊断手段，因此建立简单、高灵敏的检测miRNAs分析方法非常重要。

G-四聚体DNA酶可催化鲁米诺和H₂O₂产生化学发光，结合纳米材料、核酸适配体组装、电化学等技术手段，建立了众多检测miRNAs分析方法。但是，很多方法都存在背景信号高的问题。目前已建立的高灵敏度的检测miRNAs的方法主要基于信号放大或标记等手段，具有成本高、实验过程复杂等缺点。因此，有必要开发一种新型的低背景、无标记、无需信号放大步骤的高灵敏度识别miRNAs的方法。

技术实现要素：

本发明利用阻断DNA预先封闭探针DNA链上的富G适配体序列两端，降低背景信号，目标miRNA-21通过互补配对置换出阻断DNA，激活预先封闭富G适配体序列，形成高催化活性的分子内G-四聚体DNA酶。加入鲁米诺和H₂O₂后，化学发光信号得到大大增强。

本发明的技术方案如下：

(1)将500pM探针DNA与1000pM阻断DNA在HEPES缓冲中孵育一个小时。

(2)在(1)所述的混合溶液中加入目标miRN-21继续孵育三个小时；

(3)在(2)所述的混合溶液中加入2.5nM氯化血红素继续孵育半个小时；

(4)取(3)所述的溶液100uL，加入50uL 2×10^-3M的鲁米诺溶液和50uL 20mM H₂O₂溶液，用化学发光仪采集化学发光信号，分析测定结果。

发明效果

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)实验过程简单、成本低、无需标记和和信号放大等技术；

(2)与目前无放大无标记的DNA酶设计相比，本方法的信背比提高了4倍以上；

(3)灵敏度极高，可区别不同miRNA，含有基因突变的miRNA也能很好识别；

(4)通过改变探针DNA部分序列可实现对不同miRNAs识别。

具体实施方式

实施例1

将500pM探针DNA与1000pM阻断DNA在HEPES缓冲中孵育一个小时。向混合溶液中加入不同类型的miRNA继续孵育3个小时后，加入2.5nM氯化血红素再次孵育半个小时。取孵育后的溶液100uL，加入50uL 2×10^-3M的鲁米诺溶液和50uL 20mM H₂O₂溶液，用化学发光仪采集化学发光信号，分析其测定结果。结果显示，只有miRNA-21产生较强的化学发光信号，浓度为miRNA-21的10倍的miRNA-let 7a、miRNA-let 7c和miRNA-let 7j均没有明显的信号增加或降低现象。该方法能够很好识别目标miRNA。

实施例2

将500pM探针DNA与1000pM阻断DNA在HEPES缓冲中孵育一个小时。向混合溶液中加入miRNA-21，一个碱基突变和两个碱基突变的miRNA-21继续孵育3个小时后，加入2.5nM氯化血红素再次孵育半个小时。取孵育后的溶液100uL，加入50uL 2×10^-3M的鲁米诺溶液和50uL 20mM H₂O₂溶液，用化学发光仪采集化学发光信号，分析其测定结果。结果显示，浓度为miRNA-21的10倍的含有基因突变的miRNA-21产生的化学发光信号没有明显增加或降低现象，该方法能够很好的区分miRNA的基因突变。