专利名称：一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子酶学与生物技术，具体涉及一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因，同时涉及该突变株编码基因的制备方法。该突变基因编码的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白，可以广泛应用于食品、医药及生物等领域。
背景技术：
葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。目前应用中使用的葡萄糖氧化酶的生产一般都采用黑曲霉和青霉属菌株作生产菌，进行深层通风培养的方法制取。我国和美国常以点青霉和黄色青霉为生产菌种，日本则筛选出尼崎青霉作为常用菌种。
自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。
在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产[12]。
在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生[36]。此外，由于可以催化生成H2O2，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。
GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。
由于GOD具有广泛的实用价值，随着GOD在酵母中外源表达的成功，也有人利用定向进化的手段改造GOD，使酶活提高至原来的1.5倍，在热稳定性、pH稳定性方面，也得到了性质改善的突变株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的编码基因GOD-D401N/A574V，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突变酶，该突变酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在黑曲霉GOD结构基因中通过over-lap PCR引入突变，连接于表达载体，生产高酶活GOD突变酶，该突变酶的酶活是野生型的3倍，同时也具有良好的热稳定性和储存稳定性。
本发明的另一个目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的制备方法，该方法是构建酵母表达载体，利用阴离子交换层析方法纯化高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白，该方法简便，成本低廉。
本发明的再一个目的在于提供一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白及其在食品和医药上的应用，即一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在酒中和茶叶保鲜中的应用。。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施 本发明的一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征在于与野生型相比GOD结构基因上具有1752位的G突变为A和2272位的C突变为T的点突变。由以下步骤制备 1.突变酶GOD-D401N/A574V突变点的引入 (1)设计两对诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型GOD基因上1752位的G突变为A和2272位的C突变为T； (2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶SnaBI及NotI进行酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 2.鉴定重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 本发明命名所得编码高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的编码基因GOD-D401N/A574V具有如下特征 1.本发明所用的GOD野生型基因来自黑曲霉，长度为2303bp，其中结构基因长度为1752bp。
2.具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，与野生型相比在此结构基因上具有两处点突变，即为1752位的G突变为A和2272位的C突变为T。
本发明的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白可用如下方法生产。该方法包括以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京科学出版社中所述的条件进行。
1.突变酶GOD-D401N/A574V突变点的引入 (1)设计两对诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型GOD基因上G突变为A和2272位的C突变为T； (2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶SnaBI及NotI进行酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 2.鉴定重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 3.培养大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V，提取重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V； 4.限制性内切酶BglII酶切，胶回收纯化大片段，即得到酵母转化所需含突变基因的线性DNA； 5.电转化法转化毕赤酵母菌株GS115，得到突变酶GOD-D401N/A574V的生产菌株； 6.将步骤5中所得菌株转入500mL MD培养基中培养至OD600＝1.2-1.5；离心收集酵母细胞，并将细胞用20mL MM培养基洗一次；将细胞分别转入250mL MM培养基中诱导蛋白生成，每天向培养物中补加1％甲醇，培养4-5天；离心收取上清液； 7.将近500mL含有目标蛋白的培养物上清液超滤浓缩至20-30mL，浓缩液在0.02mol/L、pH6.27的磷酸二氢钠缓冲液中透析除盐24小时。蛋白质的纯化采用Q SepharoseTM Fast Flow阴离子交换层析柱分离、纯化，由此得到具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白； 8.以新鲜的Sigma公司商品GOD作标准曲线。用pH5.6、0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根过氧化物酶溶液。在九十六孔板中分别加入100μL葡萄糖溶液、100μL的ABTS和辣根过氧化物酶溶液40μL，加入1μl培养液或酶液，测定OD414。
按照以上方法可以检验本发明要求保护的突变酶的活性。纯度检测可以用SDS-PAGE方法检测。
注以上提到的酵母培养基配方如下 MD(L-1)酵母基本氮源培养基(YNB)1.7g，硫酸铵5g，葡萄糖20g，生物素400μg； MM(L-1)YNB 1.7g，硫酸铵5g，甲醇12mL，生物素400μg，酪蛋白水解物10g，pH5.6。
本发明获得高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在食品、医药及生物等相关领域有着广泛的应用。
1.在pH7.0的条件下，取上述所得葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶以及ABTS混合与磷酸缓冲液中，分别加入葡萄糖标准液或酒类样品与之反应，根据标准曲线可得酒类中葡萄糖含量。本发明所保护的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的优势在于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效减少酶制剂的使用量。
2.葡萄糖氧化酶在茶叶保鲜中的应用将葡萄糖氧化酶与其底物葡萄糖混合在一起，包装于不透水但透气的薄膜袋中，密封后置于装有茶叶的密闭容器内，当密闭容器内的氧气透过薄膜进入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，与葡萄糖发生反应，从而去除密闭容器内的氧，防止茶叶被氧化而导致品质劣变。
葡萄糖氧化酶是一种广泛应用的工具酶，在食品工业中主要用于除氧、去葡萄糖；在医药行业中主要用于血糖、尿糖的测定；在生物领域中，还可以制成相应的生物传感器和酶电极，用于检测葡萄糖浓度。
所述毕赤酵母表达载体pPIC9k和毕赤酵母菌株GS115均购自invitrogen公司。所述大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司。可以根据所用的表达载体选择匹配的宿主细胞。所述重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V为本发明构建。所述大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V是具有质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的大肠杆菌菌株，保藏编号CCTCC NO M207085，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2007年6月19日，分类命名大肠杆菌DH5α/GOD-D401N/A574V。所述编码基因GOD-D401N/A574V是具有SEQUENCE NO.1的核苷酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因。所述蛋白GOD-D401N/A574V是具有SEQUENCE NO.2的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白。
本发明的优点和效果 本发明中提供的GOD突变株的核苷酸序列和蛋白质序列是一种GOD高酶活突变株的基因和蛋白质序列，未见报道。本株GOD突变株酶活是野生型酶活的2倍以上，同时也具有良好的热稳定性和储存稳定性，符合实际应用的要求。而葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用，是生物传感器领域最主要的工具酶，因此，获得高酶活的GOD，具有很高的实用价值，特别是在生物传感器的分析器件中，要在微小的面积上固定具有足够催化活性的酶，酶活的高低显得尤为重要。
图1重组质粒的构建示意图示意图 (1)用PCR方法扩增出GOD基因； (2)设计两对诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型GOD分子401位的Asp突变为Asn，574位的Ala突变为Val； (3)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶SnaBI及NotI进行酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 图2重组表达质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的PCR鉴定(b)和酶切鉴定(a)结果(1％琼脂糖凝胶电泳)。
如图2(b)所示，以上下游引物扩增出的条带大小约为1800bp，与GOD结构基因大小一致。
大肠杆菌-酵母穿梭质粒pPIC9k大小约9.3kb，含有两个Bgl II酶切位点。而GOD基因内部则无Bgl II酶切位点。将质粒pPIC9k-GOD用Bgl II酶切，电泳结果如图2(a)中所示，Bgl II酶切pPIC9k-GOD得到2.4kb和8.7kb两个片段，与推测值一致。以上结果证明高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因GOD-D401N/A574V已克隆到酵母表达载体pPIC9k。
图3纯化后的毕赤酵母菌株pPIC9kGOD-D401N/A574V诱导表达产生高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白(10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)。
葡萄糖氧化酶单体分子量约为80kDa，与结果相符。
图4与野生型的热稳定性比较 在40℃中水浴保存50分钟内，野生型和GOD-D401N/A574V酶活都没有明显损失，60分钟时野生型酶活略有下降，而GOD-D401N/A574V的酶活没有明显下降。在50℃中1小时后，突变株GOD-D401N/A574V酶活降至原来的78％左右，而野生型酶活则降至原来的72％，两者相近。60℃下10分钟后，野生型和GOD-D401N/A574V酶活均大幅下降，一小时后，野生型降至原来的30％，GOD-D401N/A574V降至原有的20％左右。高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V具有良好的热稳定性，能够满足实际应用的需要。
图5与野生型的储存稳定性比较 在4℃下，野生型和GOD-D401N/A574V具有较好的储存稳定性，保存一个月后仍保留80％以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天时野生型有60％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍有80％活力剩余。在室温(20-25℃)下长时间储存时，野生型和GOD-D401N/A574V的酶活都呈现逐步下降趋势。在保存的前25天，GOD-D401N/A574V酶活的下降略高于野生型酶。但在储存后期，野生型酶活的下降更加明显。在室温下储存一个月后，野生型和GOD-D401N/A574V都可保留65％以上的剩余活力，40天后，野生型仅40％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍然有60％活力剩余。
高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V与野生型相比具有良好的储存稳定性，能够满足实际应用的需要。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例中的实验方法，按常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第二版，1992年，科学出版社)中所述实验方法。
实施例1.高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白的获得 图1显示了重组突变葡萄糖氧化酶基因的构建原理和过程。天然的成熟的葡萄糖氧化酶为同源二聚体，每个单体含583个氨基酸，基因长为1752bp左右。
1.突变酶GOD-D401N/A574V编码基因中突变点的引入 (1)设计两对诱变引物，采用PCR定点突变法在GOD基因上把野生型GOD基因上1752位的G突变为A和2272位的C突变为T； 设计葡萄糖氧化酶定点突变所需引物序列 上游引物5’-CCACTACGTAAGCAATGGCATTGAAG-3’ 下游引物5’-TATGCGGCCGCTCACTGCAT-3’ 定点突变引物 401s5′-AGAACTACCGCAACTGGATT-3′ 401a5′-CAATCCAGTTGCGGTAGTTC-3′ 574s5′TTTCGGATGTTATCTTGG 3′ 574a5′CCAAGATAACATCCGAAAT 3′ 先用上游引物与引物574a以连接有野生型葡萄糖氧化酶基因的pPIC9kGOD为模板，扩增出574的长片段，PCR循环条件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
用通用引物3’AOX1与574s以野生型葡萄糖氧化酶基因为模板，扩增出574的短片段，PCR循环条件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃20sec，30个循环；72℃5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
然后将回收的两种PCR产物混合，加入上、下游引物进行第二次PCR，PCR反应条件为94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，5个循环；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。得到含有突变位点A574V的葡萄糖氧化酶基因片段。
再用上游引物与引物574a以含有突变位点A574V的葡萄糖氧化酶基因片段为模板，扩增出401的长片段，PCR循环条件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min45sec，30个循环；72℃7min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
用下游引物与401s以含有突变位点A574V的葡萄糖氧化酶基因片段为模板，扩增出401的短片段，PCR循环条件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃20sec，30个循环；72℃5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
然后将回收的两种PCR产物混合，加入上、下游引物进行第二次PCR，PCR反应条件为94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，5个循环；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。得到含有突变位点D401N/A574V的葡萄糖氧化酶基因片段。
(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶SnaBI及NotI进行分步酶切，酶切产物用PCR产物回收试剂盒回收后，用T4连接酶与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接，16℃连接过夜后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用氨苄青霉素(Amp)-LB平板筛选得到阳性菌落，经过鉴定(见下一步骤)，命名为大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V。
2.质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的鉴定 用质粒抽提试剂盒从阳性菌落DH5α/GOD-D401N/A574V培养物中提取质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V，用限制性内切酶BglII进行酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检查，结果产生2.4Kb和8.7Kb两条带(如图2a)，与预期大小相符。进一步用PCR进行鉴定，以重组质粒为模板，用上、下游引物进行PCR，可以得到大小为1.8kb的扩增带(如图2b)，与预期大小相符。
质粒上GOD-D401N/A574V基因的测序由英俊(invitrogen)生物技术有限公司进行。测序引物是利用pPIC9k质粒上的通用引物5’AOX1和3’AOX1，测序结果表明获得的GOD-D401N/A574V基因序列与预期设计完全一致，由此得到SEQUENCE NO.1所示的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因GOD-D401N/A574V，GOD-D401N/A574V基因全长1752nt(包括终止密码TGA)，编码583个氨基酸的蛋白。将产生的质粒命名为pPIC9kGOD-D401N/A574V。
3.重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的提取 将DH5α/GOD-D401N/A574V接种到LB培养基，37℃过夜培养，用质粒抽提试剂盒提取质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V。
4.限制性内切酶BglII酶切，胶回收纯化大片段，即得到酵母转化所需含突变基因的线性DNA。
5.电转化法转化毕赤酵母菌株GS115，经筛选和鉴定获得毕赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V。
(1)GS115感受态细胞的制备 将GS115接于50mL液体YPD培养基中30℃培养过夜，再以2∶100的比例接种于500mlYPD中30℃培养至OD600＝1.2-1.5，4℃1500g离心收集细胞；用500mL冰冷的无菌水重悬细胞，4℃1500g离心收集细胞；再用250mL冰冷的无菌水重悬细胞，4℃1500g离心收集细胞；接着用40ml冰冷的1mol/L山梨醇重悬细胞，4℃1500g离心收集细胞；重悬细胞于1mL1mol/L山梨醇。
(2)重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V转化GS115 100μL原生质体与5-10μg线性化质粒DNA(BglII切)混合，转入冰冷的电转杯，放置5分钟；电击细胞与DNA的混合物(1.5kv，4.2-4.9ms)；加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，继续放置30min；再加入0.5mLSOS(0.3×YPD，1mol/L山梨醇)，30℃放置2小时，偶尔摇动志菌体不易沉淀；用1mol/L山梨醇稀释菌体后涂布于固体MD培养基。30℃培养4-6天后挑取阳性菌落。经过实施例3鉴定，将能产生GOD-D401N/A574V蛋白的菌株命名为GS115/GOD-D401N/A574V。
6.毕赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V经甲醇诱导产生GOD-D401N/A574V蛋白 从上述MD平板中挑取GS115/GOD-D401N/A574V单菌落于20mL MD培养基中培养过夜；将培养物转入500mL MD培养基中培养至OD600＝1.2-1.5；离心收集酵母细胞，并将细胞用20mL MM培养基洗一次；将细胞转入250mL MM培养基中诱导蛋白生成，每天向培养物中补加1％甲醇，培养4-5天；离心收取上清液。
7.高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V纯化 将近500mL含有目标蛋白的培养物上清液超滤浓缩至20-30mL，浓缩液在0.02mol/L、pH6.27的磷酸二氢钠缓冲液中透析除盐24小时，以保证阴离子交换柱的吸附性质。
蛋白质的纯化采用Q SepharoseTM Fast Flow阴离子交换层析柱，柱子用20mM磷酸二氢钠(pH6.3)平衡，上样后，用20mM磷酸二氢钠，0-0.2MNaCl(pH6.3)梯度洗脱，用核酸蛋白质检测仪(波长280nm)监视收集，葡萄糖氧化酶最先直接从柱中流出(带黄色)。由此得到分离纯化的如SEQUENCENO.2所示的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V。
实施例2毕赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V表达的GOD-D401N/A574V蛋白的活性检测以及其他酶学性质检测 以新鲜的Sigma公司商品GOD作标准曲线。用pH5.6、0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根过氧化物酶溶液。在九十六孔板中分别加入100μL葡萄糖溶液、100μL的ABTS和辣根过氧化物酶溶液40μL，加入1μL培养液或酶液，反应3-5分钟后测定OD414。
用Bio-Rad公司生产的蛋白质浓度测定试剂盒测定，以BSA作标准曲线。
计算酶比活
由上表可知，高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V酶活力是野生型的3倍，在酶活方面，有大幅提高。
热稳定性分析 催化活性提高的突变体有时会伴随热稳定性的降低，将野生型和突变株酶液分别置于40℃、50℃、60℃下，每隔十分钟取样在室温下测定剩余酶活，评价了酶的热稳定性。结果见图四。在40℃中水浴保存50分钟内，野生型和GOD-D401N/A574V酶活都没有明显损失，60分钟时野生型酶活略有下降，而GOD-D401N/A574V的酶活没有明显下降。在50℃中1小时后，突变株GOD-D401N/A574V酶活降至原来的78％左右，而野生型酶活则降至原来的72％，两者相近。60℃下10分钟后，野生型和GOD-D401N/A574V酶活均大幅下降，一小时后，野生型降至原来的30％，GOD-D401N/A574V降至原有的20％左右。高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V具有良好的热稳定性，能够满足实际应用的需要。
储存稳定性分析 将酶液保存在4℃和室温(20-25℃)下，定期(每隔3-4天)取样测定酶活，评价了酶的储存稳定性。结果见图五。
在4℃下，野生型和GOD-D401N/A574V具有较好的储存稳定性，保存一个月后仍保留80％以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天时野生型有60％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍有80％活力剩余。在室温(20-25℃)下长时间储存时，野生型和GOD-D401N/A574V的酶活都呈现逐步下降趋势。在保存的前25天，GOD-D401N/A574V酶活的下降略高于野生型酶。但在储存后期，野生型酶活的下降更加明显。在室温下储存一个月后，野生型和GOD-D401N/A574V都可保留65％以上的剩余活力，40天后，野生型仅40％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍然有60％活力剩余。
高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白GOD-D401N/A574V与野生型相比具有良好的储存稳定性，能够满足实际应用的需要。
GOD-D401N/A574V在酶活提高的同时，仍然具有良好的热稳定性和储存稳定性，能够满足实际应用的要求。
实施例3葡萄糖氧化酶在酶法测定酒中葡萄糖含量中的应用 在pH7.0的条件下，取上述所得葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶以及ABTS混合与磷酸钠缓冲液(0.1mol/L)中，其中葡萄糖氧化酶终浓度为10U/mL，辣根过氧化物酶终浓度为10U/mL，ABTS终浓度为0.1mg/mL。
取上述混合液3mL，分别加入葡萄糖标准液或酒类样品0.5mL与之37℃水浴反应10min，测定其在414nm处的吸收。根据标准曲线可得酒类(白酒、红酒、啤酒)中葡萄糖含量。本发明在含葡萄糖150mg/L以内，吸光度与样品葡萄糖含量具有良好的正相关性。故测定范围在0-150mg/L。
实施例4葡萄糖氧化酶在茶叶保鲜中的应用 将葡萄糖氧化酶与其底物葡萄糖以摩尔比1∶100000的比例混合在一起，包装于不透水但透气的薄膜袋中，密封后置于装有茶叶的密闭容器内，加入量为每升6-8g混合物，当密闭容器内的氧气透过薄膜进入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，与葡萄糖发生反应，从而去除密闭容器内的氧，防止茶叶被氧化而导致品质劣变，茶叶的保质期延长至18-24个月。。
葡萄糖氧化酶是一种广泛应用的工具酶，在食品工业中主要用于除氧、去葡萄糖；在医药行业中主要用于血糖、尿糖的测定；在生物领域中，还可以制成相应的生物传感器和酶电极，用于检测葡萄糖浓度。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院武汉病毒研究所
<120>一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
<130>一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2303
<212>DNA
<213>Aspergillus niger
<400>1
gaattcggta ttctcggcat ggccaaagtc ggtatccctt ggcgccacga tgatttgcgt 60
ccaggattcg tatagttcct cgtccacgag ctgcctaccg tcagcgtgag gcagtgagct 120
aatatggggc caataagcca ctacgaggat gacatggcct ctacagaacg agagacgcag 180
aggatcagga cgccaatcct gcgctccacc tgtctaagga ttcgcttttg gactatccag 240
ggattatggc ttcggattat tgtattcggg ataccgacgg ctgagcacac ggaggatgag 300
gttcagctca cggcccctat cagtatgcat tatgaggatg gcttcttgga aagcagagga 360
attggattat cgaacaagtt ggttctggac cattgactcg agcgtataag taacctcgtt 420
cggtcctcct gtcaccttct gatcagcaac cagcctttcc tctctcattc cctcatctgc 480
ccatcatgca gactctcctt gtgagctcgc ttgtggtctc cctcgctgcg gccctgccac 540
actacatcag gagcaatggc attgaagcca gcctcctgac tgatcccaag gatgtctccg 600
gccgcacggt cgactacatc atcgctggtg gaggtctgac tggactcacc accgctgctc 660
gtctgacgga gaaccccaac atcagtgtgc tcgtcatcga aagtggctcc tacgagtcgg 720
acagaggtcc tatcattgag gacctgaacg cctacggcga catctttggc agcagtgtag 780
accacgccta cgagaccgtg gagctcgcta ccaacaatca aaccgcgctg atccgctccg 840
gaaatggtct cggtggctct actctagtga atggtggcac ctggactcgc ccccacaagg 900
cacaggttga ctcttgggag actgtctttg gaaatgaggg ctggaactgg gacaatgtgg 960
ccgcctactc cctccaggct gagcgtgctc gcgcaccaaa tgccaaacag atcgctgctg 1020
gccactactt caacgcatcc tgccatggtg ttaatggtac tgtccatgcc ggaccccgcg1080
acaccggcga tgactattct cccatcgtca aggctctcat gagcgctgtc gaagaccggg1140
gcgttcccac caagaaagac ttcggatgcg gtgaccccca tggtgtgtcc atgttcccca1200
acaccttgca cgaagaccaa gtgcgctccg atgccgctcg cgaatggcta cttcccaact1260
accaacgtcc caacctgcaa gtcctgaccg gacagtatgt tggtaaggtg ctccttagcc1320
agaacggcac cacccctcgt gccgttggcg tggaattcgg cacccacaag ggcaacaccc1380
acaacgttta cgctaagcac gaggtcctcc tggccgcggg ctccgctgtc tctcccacaa1440
tcctcgaata ttccggtatc ggaatgaagt ccatcctgga gccccttggt atcgacaccg1500
tcgttgacct gcccgtcggc ttgaacctgc aggaccagac caccgctacc gtccgctccc1560
gcatcacctc tgctggtgca ggacagggac aggccgcttg gttcgccacc ttcaacgaga1620
cctttggtga ctattccgaa aaggcacacg agctgctcaa caccaagctg gagcagtggg1680
ccgaagaggc cgtcgcccgt ggcggattcc acaacaccac cgccttgctc atccagtacg1740
agaactaccg caactggatt gtcaaccaca acgtcgcgta ctcggaactc ttcctcgaca1800
ctgccggagt agccagcttc gatgtgtggg accttctgcc cttcacccga ggatacgttc1860
acatcctcga caaggacccc taccttcacc acttcgccta cgaccctcag tacttcctca1920
acgagctgga cctgctcggt caggctgccg ctactcaact ggcccgcaac atctccaact1980
ccggtgccat gcagacctac ttcgctgggg agactatccc cggtgataac ctcgcgtatg2040
atgccgattt gagcgcctgg actgagtaca tcccgtacca cttccgtcct aactaccatg2100
gcgtgggtac ttgctccatg atgccgaagg agatgggcgg tgttgttgat aatgctgccc2160
gtgtgtatgg tgtgcaggga ctgcgtgtca ttgatggttc tattcctcct acgcaaatgt2220
cgtcccatgt catgacggtg ttctatgcca tggcgctaaa aatttcggat gttatcttgg2280
aagattatgc ttccatgcag tga2303
<210>2
<211>583
<212>PRT
<213>Aspergillus niger
<400>2
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385390 395 400
Asn Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Val Ile Leu
565 570575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
权利要求
1.一种分离的高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白编码基因，其序列为SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种大肠杆菌，其特征在于大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/GOD-D401N/A574V，CCTCC NO.M207085。
4.一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在酒中的应用。
5.一种高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在茶叶保鲜中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高活力葡萄糖氧化酶突变体编码基因及制备方法和应用。这种高活力葡萄糖氧化酶突变体的编码基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步骤是首先设计两对诱变引物；第二是获得大肠杆菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V；第三是鉴定重组质粒pPIC9kGOD-D401N/A574V；第四是培养大肠杆菌菌株DH5α/GOD--D401N/A574V；第五是得到含突变基因的线性DNA；第六是获得毕赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V；第七是诱导纯化获得目的蛋白。本发明方法易行，成本低廉，高酶活葡萄糖氧化酶突变株蛋白在食品糖类检测和保鲜中的应用，具有很高的实用价值。
文档编号C12N15/53GK101348794SQ20071005278
公开日2009年1月21日 申请日期2007年7月19日 优先权日2007年7月19日
发明者周亚凤, 张先恩, 丹 刘, 郭永超, 张治平 申请人:中国科学院武汉病毒研究所