一种利用凝胶电泳鉴别绿潮浒苔属藻类的方法与流程

本发明属于大型海藻生物检测领域，特别涉及一种用凝胶电泳法鉴别4种主要的浒苔类绿藻(浒苔、扁浒苔、曲浒苔、缘管浒苔)的方法。

背景技术：

绿潮是在特定的环境条件下，海水中某些大型绿藻暴发性增殖、聚集而导致的一种有害生态现象。自20世纪70年代以来，绿潮在世界范围内的发生频率和影响规模呈现上升趋势，美国、加拿大、丹麦、荷兰、法国、意大利、日本、韩国和菲律宾等国家均有绿潮灾害报道。我国自2007年开始连续十年在南黄海海域暴发大规模绿潮，初次之外，近几年绿潮也陆续在我国沿海多地暴发，如广西北海银滩、厦门海沧湖、海南三亚大东海等，并呈现连续性和常态化的暴发趋势。急剧增殖的绿潮藻给我国沿海城市的水产养殖业、旅游业、居民生活等带来了诸多负面影响，造成了严重环境灾害。

对绿潮暴发主要藻种进行种类鉴别是绿潮研究中最重要的工作之一。我国黄海的绿潮藻主要有浒苔、缘管浒苔、曲浒苔和扁浒苔，其中浒苔为优势种，具有生物量大、影响面积大、影响岸线长、迁移距离大等特点。常用的种类鉴别方法主要分为形态学鉴别法和分子生物学鉴别方法。

形态学鉴别方法是一种传统的分类鉴别方法，主要通过个体水平研究藻体的形态特征和生活史特点；细胞水平研究藻体细胞大小、细胞排列方式、细胞分裂特点和生殖发育方式等；亚细胞水平研究细胞器形态结构和定位特征等。技术方法主要涉及野外采集、纯系培养、切片染色、光镜电镜技术等。依据研究结果，制订相关分类标准作为水平鉴别依据。然而随着研究发现，绿潮藻具有高度的形态可塑性，随着环境变化，同一物种的形态特征具有很大差异，因此，单纯依靠形态学鉴别方法对藻种进行鉴别具有一定难度。

分子生物学方法的引入和使用，不仅补足了形态学鉴别方法的不足，同时也提供了更多藻种的进化和遗传信息。常用的技术方法包括分子标记、环介导等温扩增联合横向流动试纸条技术、浒苔的荧光原位杂交技术等。这些技术虽然都可以进行藻种鉴别，但是存在着耗时长或成本高等问题。

技术实现要素：

本发明针对当前技术存在缺点和不足，发明了一种利用凝胶电泳鉴别绿潮浒苔属藻类的方法，能快速有效的判断绿潮藻种类，而且成本低，耗时短。

本发明提供的利用凝胶电泳鉴别绿潮浒苔属藻类的方法，包括以下步骤：

(1)藻体样品总DNA提取；

(2)5S rDNA间隔区序列和ITS序列分别进行PCR扩增；

其中，5S rDNA间隔区引物序列为：

5S-F：5′-GGTTGGGCAGGATTAGTA-3′(18bp)，SEQ ID NO.1；

5S-R：5′-AGGCTTAAGTTGCGAGTT-3′(18bp),SEQ ID NO.2；

其中，ITS引物序列为：

ITS-F：5′-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′(21bp)，SEQ ID NO.3；

ITS-R：5′-TTCCTTCCGCTTATTGATATGC-3′(22bp)；SEQ ID NO.4。

(3)琼脂糖凝胶电泳鉴别，电泳结束后，通过观察电泳带及其位置，通过条带状况分析判断绿潮浒苔类藻种。具体为，配制浓度为1％的琼脂糖凝胶，并加热熔化至溶液清亮透明无颗粒，冷却片刻，加入4S Red Plus核酸染料并混匀，倒入制胶平板中，插入梳子，待其凝固之后，小心拔出梳子，并把胶板放入电泳槽内，电泳槽内的电泳缓冲液量以没过胶面1mm为宜，最后，取PCR扩增产物5ul加入被浸没的凝胶加样孔内，接通电源，一般150V电压，电泳25min即可。电泳完毕，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，通过条带状况分析判断绿潮浒苔类藻种。

其中，步骤(1)中所述藻体样品总DNA提取的方法为采用植物基因组DNA提取试剂盒法对野外采集的样品进行总DNA提取。

其中，步骤(2)中的所述5S rDNA间隔区序列和ITS序列PCR扩增反应体系包括25ul PCR mix、10uM正反向引物各2ul、DNA模板2ul和双重蒸馏水ddH₂O 19ul。

其中，步骤(2)中的所述5S rDNA间隔区序列PCR扩增反应体系包括94℃预变性3min，94℃40s、52℃40s、72℃70s共30个循环，最后65℃延伸10min。

其中，步骤(2)中的所述ITS序列PCR扩增反应体系包括94℃预变性5min，94℃40s、55℃40s、65℃70s共30个循环，最后65℃延伸10min。

本发明的有益效果是实验操作简单，无需送至测序公司进行测序，所以成本较低，耗时较短，数据准确。

附图说明

图1是实施例1中5S序列扩增产物电泳胶图

图2为实施例1中ITS序列扩增产物电泳胶图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

自江苏如东紫菜养殖笩架上采一定量的成体藻体样品，并带回实验室。在实验室中，用蒸馏水和毛刷对样品进行刷洗，并挑选形态特征不同的藻体样品，将藻体样品用纸巾吸干，放入1.5ml的离心管中，之后进行如下步骤：

(1)藻体样品总DNA提取：按照天根植物基因组DNA提取试剂盒的步骤对江苏如东紫菜养殖笩架采集的已预处理成体藻样品进行总DNA提取。

(2)5S rDNA间隔区序列及ITS序列PCR扩增：

将步骤(1)中所提取的DNA进行ITS序列PCR扩增：在小离心管中按照50ul的PCR反应体系加入：25ul PCRmix、ITS正反向引物(10uM)各2ul、步骤(1)中所提取DNA2ul和双重蒸馏水ddH₂O19ul。放入PCR仪内。PCR反应程序为：94℃预变性5min，接着30个循环(94℃40s，55℃40s，65℃70s)，最后65℃延伸10min。

之后，再次将步骤(1)中所提取的DNA进行5S序列PCR扩增：在小离心管中按照50ul的PCR反应体系加入：25ul PCRmix、5S rDNA间隔区序列正反向引物(10uM)各2ul、步骤(1)中所提取DNA2ul和双重蒸馏水ddH₂O 19ul。放入另一台PCR仪内。PCR反应程序为：94℃预变性3min，接着35个循环(94℃40s，52℃40s，72℃70s)，最后72℃延伸5min。

其中，以上步骤所提到ITS引物序列为：

ITS-F：5′-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′(21bp)，

ITS-R：5′-TTCCTTCCGCTTATTGATATGC-3′(22bp)，

5S rDNA间隔区引物序列则为：

5S-F：5′-GGTTGGGCAGGATTAGTA-3′(18bp)，

5S-R：5′-AGGCTTAAGTTGCGAGTT-3′(18bp)。

(3)琼脂糖凝胶电泳鉴别：配制浓度为1％的琼脂糖凝胶，并加热熔化至溶液清亮透明无颗粒，冷却片刻，加入4S Red Plus核酸染料并混匀，倒入制胶平板中，插入梳子，待其凝固之后，小心拔出梳子，并把胶板放入电泳槽内，电泳槽内的电泳缓冲液量以没过胶面1mm为宜，最后，取步骤(2)中的所有PCR扩增产物各取5ul加入被浸没的凝胶加样孔内，接通电源，一般150V电压，电泳25min即可。电泳完毕，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，通过条带状况分析判断绿潮藻种类。

在凝胶成像仪上，首先观察5S序列扩增产物电泳胶图，如图1，若电泳图呈现双条带，则该检测样品为浒苔；若电泳图呈现为单一条带，则该检测样品为曲浒苔；若电泳图呈现多条带，则该检测样品为缘管浒苔；若电泳图无条带，观察其ITS序列扩增产物电泳图，如图2，若有条带，则该检测样品为扁浒苔。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海洋大学

<120> 利用凝胶电泳鉴别绿潮浒苔属藻类的方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggttgggcag gattagta 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggcttaagt tgcgagtt 18

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgtaacaag gtttccgtag g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttccttccgc ttattgatat gc 22