猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测引物及检测方法
【技术领域】
[00011本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenI荧光 定量RT-PCR引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪德尔塔冠状病毒(Porcine DeltacoronavirusADCoV)属于冠状病毒科冠状病 毒属成员之一。该病毒在临床上主要引起仔猪腹泻、呕吐等肠道症状，和同为冠状病毒属的 猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的临床症状相似，2014年初， 美国俄亥俄州首次检测报道一种新的猪肠道冠状病毒roc〇v，截止2014年底美国发现roc〇v 感染病例的州达17个。随后在加拿和韩国也报道检测到了PDCoV，其阳性检出率高达25%， 而且roCoV和PEDV共同感染的阳性率也较高。通过序列比较发现，PDCoV和PEDV、TGEV等不属 于一个冠状病毒属，反而和S冠状病毒属中的一些的禽类冠状病毒亲缘关系较近，因此将 PDCoV归属于δ冠状病毒属。2012年，Woo等发表的文章中就有H)CoV的报道:他们对广东和香 港等地采集的哺乳动物和禽类病料进行S冠状病毒检测，其中在猪粪便样品（169份)中检测 到近10 %的PDCoV。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR引物及 检测方法。
[0004] 本发明的技术方案是：猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测引 物，
[0005] 猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0006] 上游引物：5 ' -TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3'
[0007] 下游引物:5 ' -ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3'
[0008]扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段260bp。
[0009] 利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，该 方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green I荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green I荧光定量RT-PCR反应体系，在 20μ1体系中加入以下成份:上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，质粒模板lyL，SYBR Premix Ex Taq I 10yL，ddH2〇 8yL;
[0010] 所述反应条件为:扩增参数为95°C3min; 95°C10s、53°C30s、72°C30s，循环35次。 [0011] 本发明的有益效果是：本发明根据GenBank中登录的PDC〇V(KJ567050. 1 ) Illin〇isl21株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物，经过对反应条件进行优化，建 立了检测PDCoV的SYBRGreenI荧光定量PCR方法。该方法对常见的病毒均检测不到荧光信 号，仅对roc〇v检测为阳性，其灵敏度为54拷贝AxL;组内和组间变异系数均小于1%。本试验 建立的实时荧光定量pcr具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床roc〇v的 检测。
【附图说明】
[0012] 图 1 为PCR产物琼脂糖凝胶电泳，M:DL2000Maker;l:RT-PCR product of PDCoV Ngene; 2:阴性对照；
[0013] 图2为PDCoV荧光定量PCR扩增标准曲线；
[0014] 图3为H)CoV荧光定量RT-PCR扩增特异性试验，1.阴性对照；2. TGEV;3. PPV;4. PCV 2；5. PEDV；6. PRV；7. PEDV；
[0015] 图4为荧光定量RT-PCR(A)与常规PCR(B)敏感性试验，1-7 : 5.4 X 107~5.4 X lC^copies/yMSzNegative control ;9:阴性对照。
【具体实施方式】
[0016] 本发明根据GenBank登录的roCoV的Illinoisl21株的N基因序列，通过序列分析获 得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列设计了一对特异性引物。在此基础 上建立了 roCoVSYBRGreenl荧光定量RT-PCR检测方法，并对该方法进行了评价分析，为兽医 临床的诊断和防制提供技术支持。
[0017] 猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测引物，
[0018] 猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0019 ]上游引物：5 ' -TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3'
[0020]下游引物：5 ' -ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3'
[0021]扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段260bp。
[0022] 利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，该 方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green I荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBR Green I荧光定量RT-PCR反应体系，在 20μ1体系中加入以下成份:上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，质粒模板lyL，SYBR Premix Ex Taq I 10yL，ddH2〇 8yL;
[0023] 所述反应条件为:扩增参数为95°C3min; 95°C10s、53°C30s、72°C30s，循环35次。
[0024] 本发明具体操作如下：
[0025] 1材料和方法
[0026] 1.1病毒株及临床样品
[0027] 猪DeltaC〇r〇navirUS(PDC〇V)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征 病毒(PRRSV)、猪圆环病毒II型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病毒(PRV)均 由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保存。PDCoV的临床样品来自河南各地 市及其周边地市养殖场的10日龄以内腹泻仔猪的肠道内容物。
[0028] 1.2主要试剂
[0029] pMDl8-T载体、反转录试剂盒、PCR相关试剂、DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒及 SYBR Premix Ex Taq I聚合酶均购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司。
[0030] 1.3引物的设计及合成
[0031 ] 应用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照Genbank中登录的Illinoisl21株 roc〇v N基因序列设计一对引物，扩增roc〇v N基因部分片段260bp，引物由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成。
[0032] 上游引物：5，-TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3'
[0033] 下游引物：5 ' -ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3'
[0034] 1.4重组质粒标准品的制备
[0035] 按照TRIzol总RNA提取试剂盒说明书方法提取RNA，参照Thermo反转录试剂盒说明 书进行反转录，将反转录所得cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检 测，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的片段与PMD18-T载体连接，转化感受态细 胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序正确 的阳性质粒作为DNA标准品，用分光光度仪测定浓度后进行10倍系列稀释，用于构建标准曲 线。并根据标准质粒的浓度进行分析，根据公式计算出每微升质粒液体中含有的质粒拷贝 数。
[0036] 1.5荧光定量PCR方法的优化
[0037]采用SYBR Premix Ex Taq推荐的反应体系，以出现最高焚光值、出现最小的样本 阈值循环数(Cq值）以及在融解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对退火温度、循环条 件和循环次数等进行优化。
[0038] 1.6标准曲线的绘制
[0039] 将计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释，在稀释好的标准质粒中选取7个适宜的 稀释度，以这7个稀释度的质粒液体作为标准阳性模板进行RT-PCR扩增反应，每个稀释度做 3个重复试验。对扩增结果进行分析，绘制标准曲线。
[0040] 1.7特异性试验
[00411用建立好的扩增方法对TGEV、PPV、PCV2、PEDV、PRV等病毒株基因为模板进行扩增， 并选取roc0v阳性质粒作阳性对照，灭菌水作阴性对照，检验所建立方法的特异性。
[0042] 1.8敏感性试验
[0043] 分别以5.4 X 107拷贝AiL~5.4 X 101拷贝AiL质粒标准品为模板，以进行荧光定量 RT-PCR扩增。确定能得出阳性结果的最低稀释度的拷贝数，同时用常规PCR进行检测，比较 两种方法的敏感性，同时设阴性对照。