一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物鉴别技术领域，具体涉及一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的 SNP分子标记及其鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 懦玉米(Zea mays L.certaina kulesh)是玉米胚乳WX基因发生隐性突变而形成 的一个具有丰富营养价值的特用玉米类型。我国是糯玉米的起源地，地方种质资源丰富，据 统计中国国家种质库收录懦玉米种质超过900多份。懦玉米品种鉴定不仅有助于玉米种质 资源的高效利用，同样对玉米品系的遗传多样性研究也具有重要意义。
[0003] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP在玉米基因组中分布广泛，在非编 码区平均31bp存在1个SNP，而编码区则为124bp存在1个SNPJNP分子标记具有分布广泛、遗 传稳定、具代表性、易于实现自动化分析等优势。但由于测序成本高、分析技术要求高等原 因，目前人们对地方种质资源进行全基因组水平的SNP等分子标记分析的研究仍然较少。 [0004] 近年来兴起的限制性酶切位点相关DNA(Restriction_site associated DNA, RAD)测序(RAD-seq)是一种利用限制性内切酶降低测序物种基因组复杂程度，反映部分基 因组序列结构信息的测序技术。与单酶切RAD测序技术和双酶切RAD(Double digest RAD， ddRAD)测序技术相比，基于IIB型限制性内切酶的RAD(IIB digest RAD，2b-RAD)测序技术 具有酶切DNA片段大小一致、文库构建简单快速、标签密度易于调节、成本低廉、准确性高等 优势。该技术已成功用于基因分型、高精度连锁图谱构建、群体遗传结构分析、动植物重要 经济性状的QTL定位、系统演化分析和分子流行病学研究等领域。
[0005] 沪五彩花糯1号是由上海市农业科学院和上海农科种子种苗有限公司以申W48为 母本、申W93为父本选育而成的五彩鲜食糯玉米，具有重要的农业价值和商业价值。沪五彩 花糯1号产量表现为单穗重240~260g，亩产去苞叶鲜穗净重880kg，比对照苏玉糯5号增产 16.2% ;其主要特征为株型半紧凑，株高210cm，穗位高90cm，花丝粉红色，果穗长锥型，穗长 18.1 cm，穗粗4.82cm，穗行数15行，行粒数30个，籽粒呈紫、白、黑、红、黄五色，从春播出苗至 采收约81天，采收期比对照苏玉糯5号早3天，生育后期保绿度好，籽粒较大，排列整齐，皮 薄，糯性好，口感柔软，鲜食适口性好。然而，目前关于沪五彩花糯1号品种鉴定、遗传多样性 分子基础等研究尚未展开。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于鉴定沪糯玉米五彩花糯1号的SNP分子标记及其 鉴定方法，该鉴定方法可快速鉴定某糯玉米品种是否为沪五彩花糯1号，简单、快速、高效， 对研究沪五彩花糯1号的遗传多样性提供技术支持。
[0007]为达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0008] 一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的SNP分子标记，所述SNP分子标记为利用沪 五彩花糯1号2b-RAD简并基因组测序结果分析而获得，包括9个沪五彩花糯1号的SNP位点序 列SNP1-SNP9,分子标记SNP1-SNP9的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1-9所示，具体序列见表 1〇
[0009]表 1
[0010]
[0012] 本发明所述分子标记SNP1上有SNP位点：2号染色体第174210522位，碱基为T;所述 分子标记SNP2上有SNP位点：3号染色体第23901997位，碱基为A;所述分子标记SNP3上有SNP 位点：4号染色体第174872548位，碱基为C;所述分子标记SNP4上有SNP位点：7号染色体第 118919985位，碱基为A;所述分子标记SNP5上有SNP位点：8号染色体第36687100位，碱基为 A;所述分子标记SNP6上有SNP位点：8号染色体第90708317位，碱基为T;所述分子标记SNP7 上有SNP位点：9号染色体第7175034位，碱基为T;所述分子标记SNP8上有SNP位点：10号染色 体第37080947位，碱基为A;所述分子标记SNP9上有SNP位点：10号染色体第89678307位，碱 基为C。
[0013] 本发明所述基于SNP分子标记的糯玉米沪五彩花糯1号的鉴定方法，其包括如下步 骤：
[0014] 1)根据上述SNP分子标记SNP1-SNP9分别设计引物对组合1-9,每个引物对组合包 括两个引物对，具体核苷酸序列参见表2;
[0015] 2)提取待鉴定样品的基因组DNA;
[0016] 3)根据所述引物对组合卜9对待鉴定品种的基因组DNA进行PCR扩增；
[0017] 4)对PCR扩增产物进行多态性鉴定
[0018] 对步骤3)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据指纹图谱结果判定:若 扩增产物的9个SNP位点的指纹图谱结果与下述结果完全一致，则待鉴定品种为糯玉米沪五 彩花糯1号：
[0019 ]引物对组合1:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现124bp条带；
[0020]第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现143bp条带；
[0021 ]弓丨物对组合2:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现130bp条带；
[0022]第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现149bp条带；
[0023]引物对组合3:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现294bp条带；
[0024]第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现313bp条带；
[0025] 引物对组合4:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现323bp条带；
[0026] 第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现342bp条带；
[0027]引物对组合5:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现10 lbp条带；
[0028]第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现120bp条带；
[0029]弓丨物对组合6:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现134bp条带；
[0030]第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现153bp条带；
[0031 ]引物对组合7:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现207bp条带；
[0032] 第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现226bp条带；
[0033] 引物对组合8:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现13 lbp条带；
[0034] 第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现150bp条带；
[0035]和引物对组合9:第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现220bp条带；
[0036]第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现239bp条带。
[0037] 表 2
[0038]
[0039]
[0040] 本发明还提供了所述SNP分子标记在鉴定糯玉米沪五彩花糯1号中的应用。
[0041] 本发明使用的聚合酶链式(PCR)扩增体系为常规PCR体系，不需要特殊的PCR仪和 特殊的反应试剂，任何公司生产的PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可使用并达到 试验目的。
[0042]本发明基于玉米基因组SNP位点序列设计9对AC-PCR引物组合(包括引物对组合1 -9)，用以鉴定糯玉米沪五彩花糯1号，旨在快速鉴定某糯玉米品种是否为沪五彩花糯1号，具 体是对待鉴定品种进行基因组DNA的提取，使用本发明设计的9对AC-PCR引物对组合对基因 组DNA进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶系统成像拍摄，当天即可得到品种的 鉴定结果，该方法高效、准确、可靠。
[0043]本发明利用9对引物组合，对基于聚合酶链式反应和琼脂糖凝胶电泳获得的指纹 图谱进行分析，根据9个SNP位点的电泳带型，进而确定是否是沪五彩花糯1号。
[0044]本发明的有益效果：
[0045]本发明利用沪五彩花糯1号简并基因组测序获得SNP杂合位点，再基于该SNP杂合 位点设计AC-PCR引物组合，通过常规PCR扩增技术，经琼脂糖凝胶电泳，即可将单碱基水平 的突变转换成扩增片段的大小差异，从而达到鉴定的目的，样品用量少，周期短，鉴定结果 准确，可重复性好。
[0046]本发明基于常规PCR扩增反应，利用将单碱基水平的突变转换成扩增片段的大小 差异，可快速高效地在短时间内精确鉴定沪五彩花糯1号，方法简便、快捷，有很好的应用推 广前景。
【附图说明】
[0047 ]图1为本发明实施例2中引物对组合1扩增产物的PCR电泳图。
[0048] 图2为本发明实施例2中引物对组合2扩增产物的PCR电泳图。
[0049] 图3为本发明实施例2中引物对组合3扩增产物的PCR电泳图。
[0050] 图4为本发明实施例2中引物对组合4扩增产物的PCR电泳图。
[0051 ]图5为本发明实施例2中引物对组合5扩增产物的PCR电泳图。
[0052] 图6为本发明实施例2中引物对组合6扩增产物的PCR电泳图。
[0053] 图7为本发明实施例2中引物对组合7扩增产物的PCR电泳图。
[0054] 图8为本发明实施例2中引物对组合8扩增产物的PCR电泳图。
[0055] 图9为本发明实施例2中引物对组合9扩增产物的PCR电泳图。
[0056] 图1-图9中，泳道1、2为样品1(沪五彩花糯1号），泳道3、4为样品2(申W48)，泳道5、6 为样品3(申W93)，泳道7、8为样品4(沪紫黑糯1号），泳道9、10为样品5(沪彩糯1号），泳道11、 12为样品6(沪玉糯3号）。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0058] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Smbrook等分 子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中所用试剂均可从商业途