猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病 毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪德尔塔冠状病毒（Poreine De 1 tacoronavirus，PDCoV)属于尼多病毒目 (Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的Delta冠状病 毒，为有囊膜的单股正链RNA病毒。早在2012年，Woo等发表的文章中就有H)CoV的报道:他们 对广东和香港等地采集的哺乳动物和禽类病料进行Delta冠状病毒检测，其中在猪粪便样 品（169份）中检测到近10%的PDCoVdOH年初，美国俄亥俄州首次检测报道一种新的猪肠 道冠状病毒PDCoV，截止2014年底美国发现PDCoV感染病例达17个州。随后在加拿和韩国也 报道检测到了PDCoV，其阳性检出率高达25 %。猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)与FOCoV属于同一个科，但是属于Alpha冠状病毒。首次报道于英国， 此后在世界多国均见有PEDV感染的报道，我国于1976年有PEDV感染的报道。自20世纪80年 代后期PEDV在我国呈现大面积流行。猪传染性胃肠炎病毒（Tansmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)为套式病毒目冠状病毒科、Alpha冠状病毒属的 病毒，是猪传染性胃肠炎的主要病原。由于PDCoV、TGEV和PEDV的临床表现、病理变化、流行 病学等方面非常相似，给临床诊断带来了一定的困难。诊断这三种疾病的传统方法有临床 观察、病毒分离、显微病变观察、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。然而这些方法操作较繁 复，且难以有效区分具体病毒感染情况。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠 炎病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
[0004] 本发明的技术方案是:猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病 毒多重RT-PCR检测引物：
[0005] 猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0006] 上游引物PI :5'-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3'
[0007] 下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3 '
[0008]扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp;
[0009] 猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
[0010] 上游引物 P3:5' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3 '
[0011] 下游引物P4:5 ' -TGTAACGCTAACACTCCTT-3'
[0012] 扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段101bp;
[0013] 猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下：
[0014] 上游引物 P5:5 ' -CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3'
[0015] 下游引物P6:5 ^GCAACCCAGACAACTCCA-3'
[0016] 扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。
[0017] 利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒 多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重 荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：
[0018] 所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μ1体系中加入以下成份：
[0019]
[0020]所述反应条件为：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35个循环，72°C延伸 10min〇
[0021 ] 本发明的有益效果是:根据GenBank中登录的猪Deltacoronavir(PDCoV)、猪流行 性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列，设计了 3对引物分别用于扩增 PDCoV N基因 、PEDV Μ基因和TGEV N基因的目的片段。通过对RT-PCR反应条件进行优化，建 立了检测H)CoV、PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法。敏感性和特异性结果显示，该多重RT-PCR对这3种病毒的最低检测量分别是4.05 X 101拷贝ΛΛ、4.52 X 103拷贝/VL和5.47 X 103拷 贝AiL，而对猪细小病毒(PPV)，猪伪狂犬病毒(PRV)的扩增结果均为阴性。57份临床样品的 多重RT-PCR检测结果显示，有1份同时感染这3种病毒，11份样品感染H)C 〇V，15份样品感染 PEDV，1份样品感染TGEV，5份样品感染PDCoV和PEDV，1份样品感染H)CoV和TGEV。结果表明， 建立多重RT-PCR方法能够对H)C 〇V、PEDV和TGEV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别 诊断。
【附图说明】
[0022] 图 1 多重RT-PCR电泳图，M:DL2000DNA marks UDCoV/PEDV/TGEV 2:PDCoV 3: TGEV 4:PEDV 5:阴性对照；
[0023] 图2多重RT-PCR特异性试验，M:DL2000DNA marks l:PDCoV、TGEV、PEDV多重RT-PCR 产物；2~7分别是:PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、RV的RT-PCR产物；8:阴性对照；
[0024] 图3 PDCoV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNA marks 1 ~9:4·05Χ108拷贝/yL~ 4.05X10°拷贝ΛΛ 10:阴性对照；
[0025] 图4TGEV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarksl~9:5·47X 108拷贝/μL~ 5.47X 10°拷贝ΛΛ 10:阴性对照；
[0026] 图5 PEDV的RT-PCR敏感性试验，M:DL2000DNA marks 1 ~9:4·52Χ 108拷贝/yL~ 4.52X10°拷贝ΛΛ 10:阴性对照；
[0027] 图6多重訂-?0?的敏感性试验，]?:01^0000嫩11^1^1~9:108~10()拷贝/^10:阴 性对照。
【具体实施方式】
[0028] 本发明根据GenBank登录的roCoV的HKU15-155株N基因序列，TGEV的H155株N基因 序列，PEDV的JXNC1302株Μ基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据 该特异性保守序列设计了两对特异性引物。在此基础上建立了 PDC〇V、TGEV和PEDV的多重 RT-PCR检测方法，并对此方法进行了评价分析。对河南地区送检的病料样品进行检测分析， 进一步在实践中验证方法的可靠性，从而为兽医临床的诊断和治疗提供理论依据。
[0029] 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引 物：
[0030] 猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0031 ]上游引物PI: 5，-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3'
[0032]下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3'
[0033]扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp;
[0034] 猪流行性腹泻病毒的引物序列如下：
[0035] 上游引物 P3:5 ' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3 '
[0036] 下游引物P4:5 ' -TGTAACGCTAACACTCCTT-3'
[0037] 扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段lOlbp;
[0038] 猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下：
[0039] 上游引物 P5:5，-CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3'
[0040] 下游引物P6:5 ' -GCAACCCAGACAACTCCA-3'
[0041 ]扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。
[0042]利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒 多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重 荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测：
[0043]所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μ1体系中加入以下成份：
[0044]
12 所述反应条件为：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35个循环，72°C延伸 10min〇 2 本发明具体操作如下：
[0047] 1材料和方法
[0048] 1.1病毒和细胞
[0049] 猪DeltacoronaviruMPDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒（， TGEV)、猪博卡病毒(PBoV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、ST细胞、 LLC-PK细胞、Vero细胞均由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保存。PDCoV接 种LLC-PK细胞、PEDV接种Vero细胞、TGEV接种ST细胞传至8代后出现80%以上的细胞病变 (CPE)时收毒。
[0050] 1.2主要试剂
[0051 ] pMD18-T载体、QIAamp Viral RNA Mini Kit提取试剂盒和QIAGEN反转录试剂盒购 自QIAGEN公司、PCR相关试剂、DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；TRIzol 试剂购自Invitrogen公司。
[0052] 1.3引物的设计及合成
[0053] 应用Primer Premier 5 · 0基因分析软件，参照Genbank中登录的]^CoV N基因、 PEDV Μ基因、TGEV N基因设计3对引物(表1)，扩增H)CoV N基因部分片段383bp，PEDV Μ基因 部分片段l〇lbp，TGEV Ν基因部分片段229bp引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。用双蒸水稀释为25ymol/L，-20°C保存
[0054] 表1多重RT-PCR引物信息
[0055]
[0056] 1.4病毒RNA的提取及反转录
[0057] 接毒细胞悬液和临床样品于_80°C反复冻融3次后用于病毒核酸的提取。参照 QIAampViral RNA Mini Kit提取试剂盒提取病毒总RNA，并利用反转录试剂盒制备反转录 为 cDNA，-80°C 保存。
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