5RT-PCR产物的鉴定
[0059] 单一病毒的RT-PCR反应在25yL体系中进行，包括2XTaq DNA MasterMix 25yL，上 下游引物各ΙμLΧ25μL?〇1/υ，cDNA模板2yL，ddH2〇补足25μΙ^ΡΟ?反应扩增参数为：95°C5min， 94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35个循环，72°C延伸10min JCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳 检测，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的片段与PMD18-T载体连接，转化感受态 细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
[0060] 1 · 6单一RT-PCR的反应
[0061 ]在25yL体系中进行，2XTaq DNA MasterMix 12yL，上下游引物各0·5μLΧ25μπιο1/ L)，质粒模板各lyL，ddH2〇补足25yL。反应条件为：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s， 35个循环，72°C延伸10min。取5yL RT-PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 [0062] 1 · 7 多重RT-PCR 反应
[0063] 先对多重RT-PCR反应条件，包括退火温度(53~60°C)，引物终浓度(0.1~Ιμπιο?/ L)，2 X Taq DNA MasterMix浓度，反应体积(25~50yL)进行优化，确定最佳反应条件为25yL 反应体系，包括2XTaq DNA MasterMix 12yL，2对引物上下游各0.5yL(25ymol/L)，质粒模 板各 lyL，ddH20 补足 25yL。反应条件为：95°C5min，94°C lmin，58°C30s，72°C30s，35 个循环， 72°C延伸lOmin。取5yL RT-PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0064] 1.8特异性试验
[0065] 采用建立的多重RT-PCR方法对PDCo V、PEDV、TGEV、PBo V、RV、PRRSV进行扩增，并选 择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。
[0066] 1.9敏感性试验
[0067]将测序正确的阳性质粒作为DNA标准品，用分光光度仪测定浓度后将两种质粒混 合后进行10倍系列稀释。根据公式计算出每微升质粒液体中含有的质粒拷贝数。用优化后 的反应条件进行多重RT-PCR扩增。
[0068] 1.10重复性试验
[0069]应用建立的多重RT-PCR，用优化后条件每隔一周重复检测一次，连续检测3次，以 检测结果的可靠性。
[0070] 1.11临床样品
[0071] 收集河南地区的25份猪腹泻肠内容物样品（编号1~25)、32份粪便样品（编号26~ 57)，用已经建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR反应条件同时对这57份样品进行检测。
[0072] 2 结果
[0073] 2.1多重RT-PCR产物的电泳分析
[0074] 以PDCoV、PEDV和TGEV的重组质粒为模板做单重和多重RT-PCR，并以ddH20做阴性 对照，分别扩增出PDCoV 383bp、PEDV 101bp、TGEV 229bp特异性条带；多重RT-PCR可同时扩 增出三条相应的特异性条带，阴性对照未扩出条带（图1)。
[0075] 2.2特异性试验
[0076] 用建立的多重RT-PCR方法对PDCoV、TGEV、PEDV的单一及混合质粒为模板，PBoV、 PRRSV、RV为模板分别使用建立的多重RT-PCR方法进行扩增，只有H)C〇V、TGEV、PEDV单一和 混合模板扩增出与相应目的片段大小符合的条带，而其它病毒均无条带（图2)。
[0077] 2.3单重RT-PCR敏感性试验
[0078]分别以PDC〇V、TGEV和PEDV 10倍倍比稀释的质粒（108~10°)作为模板，用建立好的 多重RT-PCR方法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05 X101拷贝AxL(图3)， TGEV最低检测量为5.47 X 101拷贝ΛΛ(图4)，PEDV最低检测量为4.52 X 101拷贝ΛΛ(图5)。 [0079] 2.4多重RT-PCR敏感性试验
[0080]以PDC〇V、TGEV和PEDV的混合质粒10倍倍比稀释后作为模板，用建立好的多重RT-PCR方法进行扩增，扩增结果显示PDCoV最低检测量为4.05 X101拷贝AxL，TGEV最低检测量 为5.47 X 103拷贝AxL，PEDV最低检测量为4.52 X 103拷贝ΛΛ(图6)。
[0081 ] 2 · 5多重RT-PCR临床样品检测结果
[0082]用建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR对河南地区的57份样品进行检测，检测结果见 表2,两种方法检测符合率是100 %。
[0083]表2临床样品检测结果
[0084]
[0085] 3 讨论
[0086] PDC〇V、TGEV和PEDV是导致仔猪腹泻疾病的常见病毒，发病率高，目前均无有效的 药物，并且三者在临床症状、流行病学和病理变化上无明显差异。在roc〇v感染的猪场，猪的 发病率和致死率非常高，给养猪业造成了巨大的经济损失。传统的检测方法，如细胞培养、 免疫学和动物实验等虽能对三者鉴别诊断，但是最大的缺点是检测周期长，灵敏度低。PCR 技术是目前鉴别诊断三者的最敏感、特异的方法。相对于单重RT-PCR方法，多重RT-PCR能同 时进行多种病原微生物的鉴别诊断，且具有灵敏度高、特异性好，方便快捷等特点，适用于 大规模检测，在动物疫病的流行病与预防中，具有不可替代的作用。
[0087]应用多重RT-PCR方法检测临床样品时，由于样品中核酸背景复杂，使RT-PCR扩增 易出现非特异性条带，对反应体系以及条件要求苛刻。因此，在建立多重RT-PCR方法时，弓丨 物设计是多重RT-PCR试验成功的关键，在设计多重RT-PCR引物时，除按常规RT-PCR引物设 计常用准则外，要求所选择的靶基因具有高度的特异性；引物间不能有连续互补的碱基，当 不可避免时，要求连续互补的碱基不能超过4个，尤其是在引物的3'端；引物之间无同源性， 不存在交叉错配、严重的引物二聚体等;不同引物的退火温度要求相近，并且扩增的目的片 段的长度相差最好在l〇〇bp以上，以便琼脂糖凝胶电泳时分辨观察。引物设计完成后，不仅 要与同种病毒的不同毒株进行比对，还要与其它病毒进行比对，确定引物的特异性。此外， 还必须对各对引物浓度配比、退火温度及其他PCR反应条件进行优化。由于样品多为粪便或 肠道内容物且其含有多种抑制PCR反应的因子，因此为获得较好的核酸质量，建议使用商品 化的核酸提取试剂盒，此外，为减少假阴性，采集新鲜样品后应尽快处理。
[0088] 本发明设计合成3对引物，以H)CoV、TGEV和PEDV混合质粒为模板，在单重RT-PCR基 础上，逐步优化RT-PCR反应体系和条件，建立了可以同时扩增roCoV N基因 、TGEV N基因和 PEDV Μ基因特异性片段的多重RT-PCR方法。2013年，霍金耀建立的多重RT-PCR检测方法中 对TGEV和PEDV的最低检测浓度均为125p g<32015年，逢凤娇在国内首次建立了PDCoV的RT-PCR检测方法，对PDCoV最低检测浓度为4.05X 103拷贝/VL。而本实验建立的多重RT-PCR对 PDCoV、TGEV和PEDV最低检测浓度分别为4.05X101拷贝/^、5.47\103拷贝/^和4.52父10 3 拷贝。表明，建立的多重RT-PCR反应具有很好的敏感性。利用此方法对河南省地区的57 份进行检测，PDCoV、TGEV和TODV单一感染率分别是19.30 %、1.75 %和26.32 %，PDCoV和 TGEV混合感染率是1.75 %，PDCoV和PEDV混合感染率是8.77 %，三者混合感染率是1.75 %。 与单重RT-PCR方法比较，两种方法的阳性检出符合率为100 %，完全可以替代单重RT-PCR， 节约了时间和成本。
[0089]综合分析表明，该方法具有良好的特异性、敏感性及可重复性，不但可以应用与 PDCoV和TGEV的流行性病学调查，也为H)CoV和TGEV早期感染的快速诊断奠定了重要基础。
【主权项】
1. 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物， 其特征在于： 猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下： 上游引物Pl: 5 ' -GCGTTTCCTGGGCTGATT-3' 下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3 ' 扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp; 猪流行性腹泻病毒的引物序列如下： 上游引物 P3:5' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3' 下游引物P4:5 ' -TGTAACGCTAACACTCCTT-3' 扩增猪流行性腹泻病毒基因部分片段IOlbp; 猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下： 上游引物 P5:5' -CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3' 下游引物P6:5' -GCAACCCAGACAACTCCA-3' 扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。2. 利用权利要求1所述引物检测猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠 炎病毒多重RT-PCR的方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如 下多重荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于： 所述多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25μ1体系中加入以下成份：所述反应条件为:95°C5min，94°C Imin，58°C30s，72°C30s，35 个循环，72°C 延伸 IOmin。
【专利摘要】本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物。本发明多重RT-PCR对这3种病毒的最低检测量分别是4.05×101拷贝/μL、4.52×103拷贝/μL和5.47×103拷贝/μL，而对猪细小病毒（PPV），猪伪狂犬病毒（PRV）的扩增结果均为阴性。57份临床样品的多重RT-PCR检测结果显示，有1份同时感染这3种病毒，11份样品感染PDCoV，15份样品感染PEDV，1份样品感染TGEV，5份样品感染PDCoV和PEDV，1份样品感染PDCoV和TGEV。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/09, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN105483291
【申请号】CN201511021732
【发明人】胡慧, 曹贝贝, 张君涛, 郑兰兰, 魏战勇, 梁秀丽, 周雍
【申请人】河南农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月31日