暴露于阿莫西林4小时这一时刻时的细菌群落照片，得到如图6所示的结果。 根据大肠杆菌群落大小和形态，判断完全抑制和不抑制的群落，如图6中在浓度为0. 5mg/ L时大肠杆菌在正常生长并形成菌落，完全不抑制；而在浓度为3mg/L时大肠杆菌形态发生 变化并且未发生分裂增殖，说明被完全抑制。通过此步骤可以粗略估计大肠杆菌对阿莫西 林的耐药程度，从图6中可知在3mg/L时该大肠杆菌就被抑制，说明是敏感菌而不是耐药 菌。
[0075] (3)按照实施例1中的步骤，重新制备微流控芯片，使用荧光素模拟药物，操作如 下：
[0076]A、配制浓度分别为0mM、lmM、5mM和20mM的荧光素溶液，在两个通孔中由低到高分 别加入0. 05mL不同浓度的荧光素，每种浓度的荧光素溶液加入30min后用荧光显微镜拍摄 两孔之间的琼脂层荧光图片，拍摄完成后将该浓度的荧光素溶液取出再滴加更高浓度的荧 光素溶液，即首先在两个通孔中均加入OmM的荧光素溶液（空白），30min后拍摄两孔之间 的琼脂层荧光图片，然后取出荧光素溶液再次滴加ImM的荧光素溶液，30min后拍摄两孔之 间的琼脂层荧光图片，依次类推直至滴加20mM的荧光素溶液，30min后拍摄两孔之间的琼 脂层荧光图片。通过ImageJ软件对图片进行分析得到该浓度下的荧光素强度，从而获得不 同焚光素浓度下的焚光强度。以焚光素的浓度为横坐标，以焚光素的焚光强度为纵坐标，建 立标准曲线，如图3所示，在荧光素浓素为OmM?20mM的范围内，荧光强度与荧光素浓度成 正比。
[0077]B、在两个通孔中分别加入0.05mL10mM异硫氰酸荧光素（F4274,sigma，分子量为 332. 31)的水溶液和0. 05mL的纯水，用荧光显微镜记录扩散0-6h内两个通孔边缘之间最短 连线的不同位置处荧光素的荧光强度，以不同位置处与1#孔之间的距离为横坐标，荧光强 度为纵坐标，建立两者之间的关系曲线，得荧光素在两个通孔边缘之间的最短连线内的分 布图，如图4所示，分别为扩散10min、20min和360min后荧光素在两个通孔边缘之间的最 短连线的分布图。由图4可知，当间距为1mm时，扩散20min浓度梯度即达到稳定。
[0078]C、由于荧光强度与荧光素的浓度成正比，并且在20min时浓度梯度达到稳定，因 此选择扩散lh时两个通孔边缘之间的最短连线的不同位置处荧光素的荧光强度分布，得 两个通孔边缘之间的最短连线处不同位置处阿莫西林的浓度，如图5所示。
[0079] (4)利用图像软件ImageJ对菌落的面积进行计算，菌落面积可代表生物量。通 过菌落面积计算大肠杆菌在不同阿莫西林浓度条件下的比生长速率U，计算方法见公式 1-1，通过比生长速率得到抑制率IR，其计算方法见公式1-2 :
[0080]
【主权项】
1. 一种微流控芯片，它由依次叠加的聚二甲基硅氧烷层、琼脂糖层和透明板组成； 所述聚二甲基硅氧烷层设有两个通孔； 所述琼脂糖层由琼脂糖和分散于其中的微生物组成，由所述透明板支撑。
2. 根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述通孔的孔径为5?8mm，两个 所述通孔的中心距离为6?10mm。
3. 根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于：所述聚二甲基硅氧烷层的厚 度为5?8mm ; 所述琼脂糖层的厚度为〇. 03?0. 05mm。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的微流控芯片，其特征在于：所述微生物为细菌。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的微流控芯片，其特征在于：所述透明板为玻璃板、 石英玻璃板或者透明塑料板。
6. 权利要求1-5中任一项所述微流控芯片的制备方法，包括如下步骤： (1) 在聚二甲基硅氧烷层上打孔得到所述通孔； (2) 将微生物分散于琼脂糖中，制得琼脂糖和微生物的混合液； (3) 将所述琼脂糖和微生物的混合液滴加到所述透明板上，用步骤（1)得到的聚二甲 基硅氧烷层按压后粘合，经凝固即可得到所述微流控芯片。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)中，所述微生物以微生物悬 浊液的形式添加，所述微生物处于对数期； 所述琼脂糖以琼脂糖水溶液的形式添加； 所述微生物悬浊液与所述琼脂糖水溶液的体积比为1 :1?2 ; 所述微生物悬浊液中所述微生物的〇D_值为0. 2?0. 4 ; 所述琼脂糖水溶液中琼脂糖的质量百分含量为2?4%。
8. 利用权利要求1-7中任一项所述的微流控芯片快速检测微生物耐药性的方法，包括 如下步骤： (1) 在两个所述通孔中，分别加入药物和所述微生物的培养基； (2) 在步骤（1)后的0?6小时内，拍摄所述观察区域内不同位置处所述微生物的照 片，得所述观察区域内不同位置处所述微生物随时间变化的生长情况； 取2?6小时中某一时刻所述观察区域内不同位置处所述微生物的照片，观察所述微 生物的形态，采用图像软件计算所述观察区域内不同位置处所述微生物的群落大小，根据 所述药物的浓度和所述微生物的群落大小即可对所述微生物的耐药性进行检测； 所述观察区域为两个所述通孔的边缘之间的最短连线处所述药物在所述琼脂糖层内 扩散形成的区域。
9. 根据权利要求8所述的快速检测微生物耐药性的方法，其特征在于：所述药物以溶 液的形式进行添加，所述药物的溶液为将所述药物溶于所述微生物的培养基中得到。
10. 根据权利要求8或9所述的快速检测微生物耐药性的方法，其特征在于：所述方法 还包括采用荧光素模拟所述药物，即根据所述观察区域内不同位置处所述荧光素的浓度， 得所述观察区域内不同位置处所述药物的浓度的步骤： (1)在两个所述通孔中，加入相同浓度的荧光素的水溶液，加入20?30min后用荧光显 微镜拍摄所述观察区域内的照片，利用图像软件计算得到该浓度下的荧光强度，取出该浓 度的荧光素的水溶液，加入更高浓度的荧光素的水溶液，得不同浓度的荧光素水溶液的荧 光强度，以所述焚光素的浓度为横坐标，以焚光素的焚光强度为纵坐标，建立标准曲线； 所述荧光素水溶液的浓度为OmM?20mM ; (2) 在两个所述通孔中，分别加荧光素的水溶液和水，扩散0?6h时，用荧光显微镜拍 摄所述观察区域内的照片，利用图像软件计算所述观察区域内不同位置处荧光素的荧光强 度； 所述荧光素的水溶液中，所述荧光素的浓度为10mM?20mM ; 所述观察区域为两个所述通孔的边缘之间的最短连线处所述荧光素在所述琼脂糖层 内扩散形成的区域； (3) 根据所述标准曲线和扩散0?6h内不同时刻所述观察区域内不同位置处所述荧光 素的荧光强度，即可得到扩散0?6h内不同时刻所述观察区域内不同位置处所述要药物的 浓度； 所述荧光素的分子量与所述药物的分子量之间的偏差小于±30%。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片。该微流控芯片，它由依次叠加的聚二甲基硅氧烷层、琼脂糖层和透明板组成；所述聚二甲基硅氧烷层设有两个通孔；所述琼脂糖层由琼脂糖和微生物组成，由所述透明板支撑。本发明微流控芯片可实现微生物的原位培养、梯度暴露和实时观察；结构简单、操作简单，可以快速制备和检验，便于普通生物实验室采用；不需要注射泵；微生物不需要有荧光，普通微生物即可；芯片的关键部件可以重复使用，成本低廉，适合日常操作。本发明方法能够实时观察到微生物在不同药物浓度下的生长状态，从而快速获得药物对微生物的抑制特征；不仅可得最小抑制浓度MIC值，还可得半数抑制浓度IC50值和整条抑制曲线。
【IPC分类】C12M1-34, C12Q1-18
【公开号】CN104593253
【申请号】CN201510026001
【发明人】李冰, 邱勇, 聂智华, 施汉昌
【申请人】清华大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月19日