富硒的海洋微藻的养殖方法及其在饲料免疫增强剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用固态条件下兼养方式规模化生产富含免疫活性成分硒的微藻并应用于畜禽饲料中形成一种新的免疫增强剂。本发明以农副产品麸皮、豆粕为主的固态培养基培养富硒的海洋微藻，并将富硒微藻粉粉碎到200目的细度，在畜禽饲料中按0.1-0.6wt%量添加富硒藻粉，来喂养畜禽。本发明用立体方式、固体培养基来大规模的培养微藻，可以节省空间，提高微藻的收集率；添加富硒藻粉使畜禽增重提高6-8%，饲料转化率提高10%，抗生素使用量减少20%。
【专利说明】富砸的海洋微藻的养殖方法及其在饲料免疫增强剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋微藻与畜禽养殖业的交叉领域，涉及到一种利用固态条件下兼养方式规模化生产富含免疫活性成分硒的微藻并应用于畜禽饲料中形成一种新的免疫增强剂。
[0002]【背景技术】
畜禽免疫增强剂也称免疫佐剂，是一类通过非特异性途径提高机体对抗原或微生物特异性反应的物质，并可改善畜禽机体的免疫应答。自1925年法国免疫学家兼兽医Ramon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗反应以来，免疫增强剂的研制已成为当今生物制品研究中的一个很重要的领域，其中微量、高效、无残留性的生物活性因子最受关注。
[0003]目前常用免疫增强剂有硒、细菌脂多糖、胞壁酰二肽、云芝多糖以及香菇多糖等。
[0004]在畜禽动物养殖中，随着集约化养殖业的发展,动物发病率越来越高,人们不得不大量使用抗生素和化学治疗剂，使得病原菌抗药性日益严重，且威胁到人类的健康。我国的畜禽饲料中添加多种抗菌药、驱虫药、激素和促生长的药物或制剂，这些药物和制剂均可导致在畜禽产品中的残留，这些残留物大多对人体的健康造成危害。所以，畜牧产品的安全性必须提高到应有的重视程度。寻找一种替代物，使之无药物残留和不污染环境，成了现代畜牧业的当务之急。它的应用可以减少因各种药物所造成的药物残留和环境污染，所以新型畜禽免疫增强剂的开发应用，在解决畜禽疫病的防治、畜牧产品的安全性和环境污染问题等方面起到积极的作用，还能提高畜牧产品品质，大幅度增加产品附加值。因此，研制一种具有自然性、无污染、无药残、无抗药性、无毒副作用和利于环境保护等特征与优势的饲用免疫增强剂已成为最新趋势。
[0005]在畜禽病临床上，比较广泛应用的是特异性高免血清、干扰素、胸腺肽和转移因子等增强免疫功能的制品，但由于这些药品大部分具有严格的种属特异性，加之目前动物药品市场比较混乱，价格高，质量难以保证，以及在临床应用中受到产品原料的来源和成本的限制。因此必须选用一种安全可靠，价廉高效，又具有广泛性免疫增强作用的免疫增强剂。所以植物源和微生物免疫增强剂最具有发展潜力，也是我国研究解决抗生素残留问题的关键课题，是冲破贸易壁垒的有效途径。随着我国肉类食品的卫生标准的提高，饲料安全是保证动物类食品安全的基本条件，发展无公害绿色食品，也是畜禽养殖当务之急。为了开拓饲料添加剂的来源，确保畜禽产品的安全，许多学者也已经把目光转到天然植物源和微生物饲料添加剂上来，它们独特的作用方式、良好的作用效果、以及无残留、无抗药性、无污染等特点受到越来越多的青睐。
[0006]微藻是地球上出现最早的生物，它们个体微小(几微米至几十微米)，一般要在显微镜下才能看到。微藻生态系统中的主要初级生产者，种类多，繁殖快，在生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。近几十年来，随着现代生物技术的应用，分离鉴定手段的提高，遗传工程、基因工程等的迅猛发展，人类对微藻的研究开发已进入一个崭新的时期。由于微藻营养丰富，富含微量元素和各类生物活性物质，而且易于人工繁殖，生长速度快，繁殖周期短，所以在医药、保健品、化妆品、水产养殖饵料、饲料添加剂、化工和环保等方面具有广阔的应用前景。
[0007]硒具有抗衰老、抗氧化、增强免疫力等如此多的生物活性功能，但无机硒却具有毒性，其使用剂量和范围都受到严格的限制。因此，只有转化为有机硒，才具有食用、饲用和保健的价值。目前有机硒大多采用动植物或微生物的转化方式来获取。研究表明，硒可参与藻细胞的代谢过程，并通过藻类的生物富集作用及沿食物链传递，对海洋动物乃至人类产生重要的影响。硒在藻体中可与脂、多糖及蛋白结合，但形成硒蛋白是其转化为有机硒的主要机制，海洋微藻大多含有丰富的营养及生物活性物质，且对许多微量元素及化合物均具有较强的富集作用，是一类选择性好、高效、成本低、操作简便的生物富集体。
[0008]本发明解决了大规模固态培养微藻技术，可以提升微藻产业化水平，还可以引领畜禽养殖产业向绿色、健康、安全方向迈进，为我国畜禽产品出口提供安全保障，为将来我国发展绿色农业、绿色畜牧业奠定强有力的基础。
【发明内容】
[0009]本发明有以下二个目的:
1.米用立体培养方式，以农副产品麸皮、豆柏为主的固态培养基培养富硒的海洋微藻。
[0010]2.将富硒海洋微藻应用于畜禽养殖。本发明目的I是这样实现的:一种富硒的海洋微藻的养殖方法，包括以下步骤:
1、配置好固体培养基:麸皮65-88wt%、豆柏8-33wt%、石灰l_2wt%、KH2P04l-2wt%,加入富硒粉0.02-0.lwt%,上述比例的配方每100公斤，加入盐度为30-35wt%。的地下海水50-83公斤搅拌均匀，置于灭菌锅内蒸煮120分钟，维持温度125°C、气压0.01-0.02MPa，将蒸煮好的上述培养基冷却到23°C，待用；
2、接种:在无菌房间内，将海洋微藻的藻种洒入上述培养基中,接种完成并搅拌
均匀；
3、立体培养:将培养基放入塑钢透明浅盘中，浅盘底布满直径3_的孔，置于无菌培养房中，通入洁净空气，通气量为ImVmin，温度21 °C-26 °C，光照度1000-3000 lx，培养42 -72小时；
4、干燥培养完成，将培养好的料，放入沸腾干燥机中干燥，控制干燥机进风口温度在50-65°C，出风口 35°C _45°C，干燥后保持物料的水分控制在10%以内。
[0011]步骤I中所述的地下海水用双层200目棉布过滤。
[0012]步骤2中所述的海洋微藻的藻种制备通过以下步骤:将海水小球藻培养至对数期后由250mL三角瓶移至3L三角瓶进行扩大培养，接种密度为40mL/L，通气量为2.0 L/min，温度控制在23 °C ±2 °C，光照强度为30001x，光暗比12h: 12h，培养基为f/2，每日定时摇动培养瓶3次，培养2d。
步骤3中所述的所述塑钢透明浅盘的规格为64CMX45CMX4.5CM。
[0013]步骤3中所述的洁净空气是指经过0.01 μ m的孔径过滤过的空气。
[0014]本发明目的2是这样实现的:一种富硒的海洋微藻在饲料免疫增强剂中的应用，包括如下步骤:将上述富硒微藻粉粉碎到200目的细度，在畜禽饲料中按0.1-0.6wt%量添加富硒藻粉，来喂养畜禽。
[0015]本发明与现有技术相比，其显著优点:
1、以麸皮和豆柏为主要原料来培养海洋微藻，成本大大降低，且原料来源容易；
2、用立体方式、固体培养基来大规模的培养微藻，可以节省空间，提高微藻的收集率； 3、添加富硒藻粉使畜禽增重提高6-8%，饲料转化率提高10%，抗生素使用量减少20%。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明所述富硒微藻粉的制备流程示意图。
【具体实施方式】
[0017]以下各实施例的制备流程见图1。
[0018]实施例一
1、藻种准备:将海水小球藻培养至对数期后由250mL三角瓶移至3L三角瓶进行扩大培养，接种密度为40111171，通气量为2.0 L/min，温度控制在23 °C ±2 °C，光照强度为30001x，光暗比12h:12h，培养基为f/2，每日定时摇动培养瓶3次，培养2d。
[0019]2、配置好固体培养基:将麸皮65wt%、豆柏33 wt%、石灰I wt%和KH2P04lwt%混合，加入富硒粉0.02wt%，上述比例的配方每100公斤，加入用双层200目棉布过滤过的盐度为35wt%。的地下海水83公斤搅拌均匀，装入蒸笼放入灭菌锅内蒸煮120分钟，维持温度125°C、气压0.01-0.02·MPa，将蒸煮好的上述培养基冷却到23°C，待用；
3、接种:在无菌房间内，将海洋微藻的藻种洒入上述培养基中,接种完成并搅拌
均匀；
4、立体培养:将培养基放入塑钢透明浅盘中，浅盘的规格为64CMX45CMX4.5CM，浅盘底布满直径3_的孔，置于无菌培养房中，通入经过0.01 μ m的孔径过滤过的洁净空气，通气量为lm3/min，温度26 °C，光照度2000 lx，培养42小时；
5、干燥培养完成，将培养好的料，放入沸腾干燥机中干燥，控制干燥机进风口温度在50°C，出风口 35°C，干燥后保持物料的水分控制在10%以内。
[0020]试验动物用25日龄断奶仔猪20头，长茂饭庄养猪场提供，吮乳饮水正常，体表健康。将选自7窝体重相当的断奶仔猪20头，随机分成A、B两组，每组10头，其中，A组和B组饲喂饲料配方相同:玉米63%、豆柏22%、麸皮7%、鱼粉6%、沸石粉2%，在A组分别加A 0.1 wt%、0.3 wt% 和 0.6wt% 的富硒藻粉。
[0021]B组不添加，A、B两组均注射大肠杆菌菌液(IX 108cfu/mL)，感染后分别于1、2、
3、4、5天规定时间用无菌注射器抽取猪静脉血液lmL，置于1.5mL离心管中，加肝素抗凝剂混匀，4°C冰箱保存24h后，5000rpm、4°C离心10min，弃沉淀，取上层血清_20°C保存备用。
[0022]试验组与对照组的饲粮，除在预混中加了“富硒藻粉混合料”和不加有所不同之外，所用基础料均相同。饲养喂养过程中，采用漏斗式饲糟自由采食，供应充足饮水，日常管理与生产相同。
[0023]免疫指标的测定，AKP、ACP、SOD和CAT的活性测定均采用江苏省南京建成生物研究所生产的试剂盒及其测定方法，实验证实，A组AKP、ACP活性在注射后第三天达最高，SOD第四天最高，而CAT注射后第二天就达最高，最高组与B组比较均呈显著性差异(p〈0.05)，ACP、CAT最高值是对照组B组的3倍之多，说明饲喂添加0.1-0.6wt%的富硒藻粉能有效激活猪的免疫活性，提高猪对微生物的抵抗能力。
[0024]仔细观察记录猪只的摄食、饮水以及精神状态，并于40日龄70日龄逐头称重，实验数据统的统计分析A组比B组于40日龄平均体重高出0.64Kg，70日龄时平均高出近2Kg，说明富硒藻粉具有一定的促长效果。
[0025]实施例二
1、藻种准备:将海水小球藻培养至对数期后由250mL三角瓶移至3L三角瓶进行扩大培养，接种密度为40mL/L，通气量为2.0 L/min，温度控制在23 °C ±2 °C，光照强度为30001x，光暗比12h:12h，培养基为f/2，每日定时摇动培养瓶3次，培养2d。
[0026]2、配置好固体培养基:将麸皮88wt%、豆柏8wt%、石灰2wt%和KH2P042wt%混合，加入富硒粉0.05wt%、上述比例的配方每100公斤，加入用双层200目棉布过滤过的盐度为34wt%。的地下海水75公斤搅拌均匀，装入蒸笼放入灭菌锅内蒸煮120分钟，维持温度125°C、气压0.01-0.02MPa，将蒸煮好的上述培养基冷却到23°C，待用；
3、接种:在无菌房间内，将海洋微藻的藻种洒入上述培养基中,接种完成并搅拌
均匀；
4、立体培养:将培养基放入塑钢透明浅盘中，浅盘的规格为64CMX45CMX4.5CM，浅盘底布满直径3mm的孔，置于无菌培养房中，通入经过0.01ym的孔径过滤过的洁净空气，通气量为lm3/min，温度25 °C，光照度2200 lx，培养60小时；
5、干燥 培养完成，将培养好的料，放入沸腾干燥机中干燥，控制干燥机进风口温度在55°C，出风口 40°C，干燥后保持物料的水分控制在10%以内。
[0027]试验动物用25日龄断奶仔猪20头，长茂饭庄养猪场提供，吮乳饮水正常，体表健康。将选自7窝体重相当的断奶仔猪20头，随机分成A、B两组，每组10头，其中，A组和B组饲喂饲料配方相同:玉米63%、豆柏22%、麸皮7%、鱼粉6%、沸石粉2%，在A组分别加A 0.1 wt%、0.3 wt% 和 0.6wt% 的富硒藻粉。
[0028]B组不添加，A、B两组均注射大肠杆菌菌液(I X 108cfu/mL)，感染后分别于1、2、
3、4、5天规定时间用无菌注射器抽取猪静脉血液lmL，置于1.5mL离心管中，加肝素抗凝剂混匀，4°C冰箱保存24h后，5000rpm、4°C离心10min，弃沉淀，取上层血清_20°C保存备用。
[0029]试验组与对照组的饲粮，除在预混中加了“富硒藻粉混合料”和不加有所不同之外，所用基础料均相同。饲养喂养过程中，采用漏斗式饲糟自由采食，供应充足饮水，日常管理与生产相同。
[0030]免疫指标的测定，AKP、ACP、SOD和CAT的活性测定均采用江苏省南京建成生物研究所生产的试剂盒及其测定方法，实验证实，A组AKP、ACP活性在注射后第三天达最高，SOD第四天最高，而CAT注射后第二天就达最高，最高组与B组比较均呈显著性差异(p〈0.05)，ACP、CAT最高值是对照组B组的3倍之多，说明饲喂添加0.1-0.6wt%的富硒藻粉能有效激活猪的免疫活性，提高猪对微生物的抵抗能力。
[0031]仔细观察记录猪只的摄食、饮水以及精神状态，并于40日龄70日龄逐头称重，实验数据统的统计分析A组比B组于40日龄平均体重高出0.71Kg，70日龄时平均高出近2.5Kg，说明富硒藻粉具有一定的促长效果。[0032]实施例三
1、藻种准备:将海水小球藻培养至对数期后由250mL三角瓶移至3L三角瓶进行扩大培养，接种密度为40mL/L，通气量为2.0 L/min，温度控制在23 °C ±2 °C，光照强度为30001x，光暗比12h:12h，培养基为f/2，每日定时摇动培养瓶3次，培养2d。
[0033]2、配置好固体培养基:将麸皮82wt%、豆柏15wt%、石灰1.5wt%KH2P04l.5wt%混合、加入富硒粉0.lwt%，上述比例的配方每100公斤，加入用双层200目棉布过滤过的盐度为30wt%。的地下海水50公斤搅拌均匀，装入蒸笼放入灭菌锅内蒸煮120分钟，维持温度125°C、气压0.01-0.02MPa，将蒸煮好的上述培养基冷却到23°C，待用；
3、接种:在无菌房间内，将海洋微藻的藻种洒入上述培养基中,接种完成并搅拌
均匀；
4、立体培养:将培养基放入塑钢透明浅盘中，浅盘的规格为64CMX45CMX4.5CM,浅盘底布满直径3mm的孔，置于无菌培养房中，通入经过0.01 μ m的孔径过滤过的洁净空气，通气量为lm3/min，温度21°C，光照度3000 lx，培养72小时；
5、干燥培养完成，将培养好的料，放入沸腾干燥机中干燥，控制干燥机进风口温度在50°C，出风口 35°C，干燥后保持物料的水分控制在10%以内。
试验动物用25日龄断奶仔猪20头，长茂饭庄养猪场提供，吮乳饮水正常，体表健康。将选自7窝体重相当的断奶仔猪20头，随机分成A、B两组，每组10头，其中，A组和B组饲喂饲料配方相同 :玉米63%、豆柏22%、麸皮7%、鱼粉6%、沸石粉2%，在A组分别加入0.6wt%富硒藻粉。
[0034]B组不添加，A、B两组均注射大肠杆菌菌液(I X 108cfu/mL)，感染后分别于1、2、
3、4、5天规定时间用无菌注射器抽取猪静脉血液lmL，置于1.5mL离心管中，加肝素抗凝剂混匀，4°C冰箱保存24h后，5000rpm、4°C离心10min，弃沉淀，取上层血清_20°C保存备用。
[0035]试验组与对照组的饲粮，除在预混中加了“富硒藻粉混合料”和不加有所不同之外，所用基础料均相同。饲养喂养过程中，采用漏斗式饲糟自由采食，供应充足饮水，日常管理与生产相同。
[0036]免疫指标的测定，AKP、ACP、SOD和CAT的活性测定均采用江苏省南京建成生物研究所生产的试剂盒及其测定方法，实验证实，A组AKP、ACP活性在注射后第三天达最高，SOD第四天最高，而CAT注射后第二天就达最高，最高组与B组比较均呈显著性差异(p〈0.05)，ACP、CAT最高值是对照组B组的3倍之多，说明饲喂添加0.1-0.6wt%富硒藻粉能有效激活猪的免疫活性，提高猪对微生物的抵抗能力。
[0037]仔细观察记录猪只的摄食、饮水以及精神状态，并于40日龄70日龄逐头称重，实验数据统的统计分析A组比B组于40日龄平均体重高出0.78Kg，70日龄时平均高出近3Kg，说明富硒藻粉具有一定的促长效果。
[0038]本发明效益预测,饲料中添加0.1-0.6wt%富硒藻粉使畜禽增重提高6-8%，饲料转化率提高10-12%，抗生素使用量减少20-23%。
【权利要求】
1.一种富硒的海洋微藻的养殖方法，其特征在于包括以下步骤:
1、配置好固体培养基:麸皮65-88wt%、豆柏8-33wt%、石灰l-2wt%、KH2P04l_2wt%，加入富硒粉0.02-0.lwt%，上述比例的配方每100公斤，加入盐度为30-35wt%。的地下海水50-83公斤搅拌均匀，置于灭菌锅内蒸煮120分钟，维持温度125°C、气压0.01-0.02MPa，将蒸煮好的上述培养基冷却到23°C，待用；
2、接种:在无菌房间内，将海洋微藻的藻种洒入上述培养基中,接种完成并搅拌均匀；
3、立体培养:将培养基放入塑钢透明浅盘中，浅盘底布满直径3_的孔，置于无菌培养房中，通入洁净空气，通气量为ImVmin，温度21 °C-26 °C，光照度1000-3000 lx，培养42 -72小时；
4、干燥培养完成，将培养好的料，放入沸腾干燥机中干燥，控制干燥机进风口温度在50-65°C，出风口 35°C _45°C，干燥后保持物料的水分控制在10%以内。
2.根据权利要求1所述的富硒的海洋微藻的养殖方法，其特征在于步骤I中所述的地下海水用双层200目棉布过滤。
3.根据权利要求1所述的富硒的海洋微藻的养殖方法，其特征在于步骤2中所述的海洋微藻的藻种制备通过以下步骤:将海水小球藻培养至对数期后由250mL三角瓶移至3L三角瓶进行扩大培养，接种密度为40mL/L，通气量为2.0 L/min，温度控制在23 °C ±2 °C，光照强度为30001x，光暗比12h: 12h，培养基为f/2，每日定时摇动培养瓶3次，培养2d。
4.根据权利要求1所·述的富硒的海洋微藻的养殖方法，其特征在于步骤3中所述的所述塑钢透明浅盘的规格为64CMX45CMX4.5CM。
5.根据权利要求1所述的富硒的海洋微藻的养殖方法，其特征在于步骤3中所述的洁净空气是指经过0.01 μ m的孔径过滤过的空气。
6.一种将权利要求1制备的富硒海洋微藻在饲料免疫增强剂中的应用，其特征在于将富硒微藻粉粉碎到200目的细度，在畜禽饲料中按0.1-0.6wt%的量添加，来喂养畜禽。
7.根据权利要求6所述的富硒海洋微藻在饲料免疫增强剂中的应用，其特征在于所述的富硒海洋微藻通过以下步骤制备: a、配置好固体培养基:麸皮65-88wt%、豆柏8_33wt%、石灰l_2wt%、KH2P04l_2wt%，加入富硒粉0.02-0.lwt%，上述比例的配方每100公斤，加入盐度为30-35wt%。的地下海水50-83公斤搅拌均匀，置于灭菌锅内蒸煮120分钟，维持温度125°C、气压0.01-0.02MPa，将蒸煮好的上述培养基冷却到23°C，待用；
b、接种:在无菌房间内，将海洋微藻的藻种洒入上述培养基中,接种完成并搅拌均匀；
C、立体培养:将培养基放入塑钢透明浅盘中，浅盘底布满直径3_的孔，置于无菌培养房中，通入洁净空气，通气量为ImVmin，温度21 °C-26 °C，光照度1000-3000 lx，培养42 -72小时；
d、干燥培养完成，将培养好的料，放入沸腾干燥机中干燥，控制干燥机进风口温度在50-65°C，出风口 35°C _45°C，干燥后保持物料的水分控制在10%以内。
8.根据权利要求7所述的富硒海洋微藻在饲料免疫增强剂中的应用，其特征在于步骤a中所述的地下海水用双层200目棉布过滤。
9.根据权利要求7所述的富硒海洋微藻在饲料免疫增强剂中的应用，其特征在于步骤b中所述的海洋微藻的藻种制备通过以下步骤:将海水小球藻培养至对数期后由250mL三角瓶移至3L三角瓶进行扩大培养，接种密度为40mL/L，通气量为2.0 L/min，温度控制在23V ±2 °C，光照强度为30001x，光暗比12h:12h，培养基为f/2，每日定时摇动培养瓶3次，培养2d。
10.根据权利要求7所述的富硒海洋微藻在饲料免疫增强剂中的应用，其特征在于步骤c中所述的所述塑钢透明浅盘的规格为64CMX45CMX4.5CM ;所述的洁净空气是指经过0.01ym的孔径过滤过的空 气。
【文档编号】C12N1/12GK103849569SQ201210516990
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月6日 优先权日:2012年12月6日
【发明者】成明, 王洪斌, 朱新迎 申请人:连云港荣盛生物科技有限公司