S14, NH4VO3, Co (NO3)2,Na2W02等营养盐，营养更全面均衡，有利于细胞快速生长；5)微藻收集方法的创新。本发明将培养后的藻液加入复合沉淀剂后，将藻液置于5°C低温且黑暗环境，由于沉淀剂的絮凝作用和温度、光照的大幅降低，藻细胞迅速休克，继而沉淀，收集速度快且沉淀完全，细胞不破碎，营养成分散失少，花钱少，操作简单，实用性强。
【附图说明】
[0015]图1为亚心形扁藻形态，其中附图标记为:1鞭毛，2眼，3蛋白核，4色素体；
[0016]图2为球等鞭金藻形态，其中附图标记为:5鞭毛，6细胞核，7白糖素，8色素体；
[0017]图3为微藻串联培养方法，其中附图标记为:9充气管，10排气管；箭头所指为气体走向。
【具体实施方式】
[0018]一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法，具体方法如下:
[0019]步骤I培养液的制备
[0020]培养液成分配方！NaHCO3I份，NH4NO30.2份，尿素0.1份，人尿0.5份，Na2S130.005份，f/2微量元素溶液I份，f/2维生素溶液I份，磷酸钙0.2份，牛粪浸出液I份，土壤浸出液 0.8 份，海泥抽取液 0.5 份，NiS14.6H20 0.02 份，NH4VO30.001 份，Co (NO3) 2.6Η200.05份，Na2WO2.2Η20 0.03份，煮沸冷却海水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用；其中f/2微量元素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):ZnSO4.4Η20 23 毫克，MnCl2.4Η20 178 毫克，CuSO4.5H20 10 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9克，Na2MoO4.2Η20 7.3 毫克，CoCl2.6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4.35 克，纯水 1000 毫升；f/2 维生素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):维生素B120.5毫克，维生素B110毫克，维生素H 0.5晕克，纯水1000晕升。
[0021]步骤2接种培养
[0022]取三个5000毫升洁净三角烧瓶，加入步骤I所述培养液2500毫升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的亚心形扁藻和球等鞭金藻藻种分别接种，接种密度亚心形扁藻
2.5万个细胞/毫升藻液，球等鞭金藻8万个细胞/毫升藻液，轻轻摇匀3分钟。用橡皮塞塞住瓶口，塞子上打上2个孔，孔的直径为9毫米，插入两根玻璃管，管的直径为8毫米，一根为充气管，另一根为排气管，第2个瓶的充气管与第一个瓶的排气管相连，第3个瓶的充气管与第2个瓶的排气管相连，这样充入的气体依次经过三个瓶子，可得到3次利用。第一个桶的充气管上端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，充入混合气体，气体成分=空气98% +纯CO2L 5% + —氧化氮0.3% +硫化氢0.2%，每天24小时不间断充气，气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；将这3个三角烧瓶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养9天，前3天调节温度至22°C，光照强度45001UX，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供间歇光，6小时连续光照，6小时连续黑暗，如此循环；第4-6天，调节温度至24°C，光照强度60001uX，每天提供15小时连续光照，然后9小时连续黑暗，如此循环，至第7天，调节温度至26°C，光照强度SOOOlux，每天24小时连续光照，没有黑暗，每个瓶子补加蒸馏水500毫升。到第9天，亚心形扁藻细胞密度可达600万/毫升藻液，球等鞭金藻藻细胞密度可达到1800万/毫升藻液，即可收集；
[0023]步骤3藻细胞收集
[0024]取硫酸亚铁，甲壳素，氯化铝各1000g，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过200目筛絹为宜)，按硫酸亚铁I份，甲壳素3份，氯化铝2份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合均匀，制成复合沉淀剂，取培养了 9天的藻液1000份，加入所述复合沉淀剂
0.4份，用空气压缩机连接一塑料管插入藻液充气搅拌、混合15分钟，将藻液置于5°C冷柜中(保持黑暗)静置、沉淀24小时，由于沉淀剂的沉淀和温度的突然降低，藻细胞迅速休克且下沉到瓶底，弃上清液，取底部粘稠牙膏状藻泥，藻细胞收集完毕。
[0025]步骤2中接种用的亚心形扁藻和球等鞭金藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如米氏提取法)，以确保接种时藻种为纯种、无污染且处于生长旺盛的指数生长期；
[0026]步骤I中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
[0027]步骤I中各种无机营养盐和维生素可预先配成母液且置于4°C冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过30天；
[0028]步骤2中所用三角烧瓶需洗刷干净后加入450毫升水，放在电炉上煮沸3分钟消毒，冷却后使用，瓶口处和橡胶塞用75%酒精拭擦以消毒灭菌；
[0029]步骤I中所述土壤浸出液制备方法:取树林中上层土壤1000份，加蒸馏水1000份，再加NaOH 2.5份，加热，煮沸45分钟，冷却，沉淀12小时，取上清液，滤纸过滤，滤液即为土壤浸出液；
[0030]步骤I中所述牛粪浸出液制备方法:取牛粪50公斤，加入麸皮3公斤，玉米面I公斤，自来水4升，充分搅拌，堆成圆锥状，自然发酵15天，后摊成薄层，阳光下暴晒3天，后取3公斤放入水桶中，加入10升蒸馏水，充分搅匀，静置，48小时后100目筛絹过滤，取滤液加热，煮沸45分钟，杀死其中的细菌、霉菌、病毒等，冷却，沉淀48小时，取上清液，即得牛粪浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，置于4°C冰箱备用；
[0031]步骤I中所述海泥抽取液制备方法:取比较肥沃又不於黑的海泥，以I份泥加2份淡水，充分搅拌均匀，静置1-2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加I克NaOH的量加入NaOH，煮沸25分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置24小时取上清液备用；
[0032]步骤2所述接种过程需在无菌操作台上进行；
[0033]步骤I 中所述 NaHCO3, NH4NO3,尿素，Na2S13, NiS14, NH4VO3, Co (NO3)2, Na2WO2等化学药品纯度均需分析纯级别。
[0034]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种海洋微藻的串联培养及快速收集方法，其特征在于具体方法如下: 步骤I培养液的制备 培养液成分配方:NaHC03 I份，NH4NO3 0.2份，尿素0.1份，人尿0.5份，Na2S13 0.005份，f/2微量元素溶液I份，f/2维生素溶液I份，磷酸钙0.2份，牛粪浸出液I份，土壤浸出液 0.8 份，海泥抽取液 0.5 份，NiS14.6H20 0.02 份，NH4VO3 0.001 份，Co (NO3) 2.6H20 0.05份，Na2WO2.2Η20 0.03份，煮沸冷却海水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用；其中f/2微量元素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):ZnS04.4H20 23 毫克，MnCl2.4H20 178 毫克，CuSO4.5H20 10 毫克，FeC6H5O7.5H20.3.9 克，Na2MoO4.2Η20 7.3 毫克，CoCl2.6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4.35 克，纯水 1000 毫升；f/2维生素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):维生素B12 0.5毫克，维生素B1 100毫克，维生素H 0.5晕克，纯水1000晕升； 步骤2接种培养 取三个5000毫升洁净三角烧瓶，加入步骤I所述培养液2500毫升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的亚心形扁藻和球等鞭金藻藻种分别接种，接种密度亚心形扁藻2.5万个细胞/毫升藻液，球等鞭金藻8万个细胞/毫升藻液，轻轻摇匀3分钟；用橡皮塞塞住瓶口，塞子上打上2个孔，孔的直径为9毫米，插入两根玻璃管，管的直径为8毫米，一根为充气管，另一根为排气管，第2个瓶的充气管与第一个瓶的排气管相连，第3个瓶的充气管与第2个瓶的排气管相连，这样充入的气体经过三个瓶子，可以得到3次利用；第一个桶的充气管上端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，充入混合气体，气体成分=空气98%+纯CO2 1.5% + —氧化氮0.3% +硫化氢0.2%，每天24小时不间断充气，气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；将这3个三角烧瓶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养9天，前3天调节温度至22°C，光照强度45001UX，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供间歇光，6小时连续光照，6小时连续黑暗，如此循环；第4-6天，调节温度至24°C，光照强度60001uX，每天提供15小时连续光照，然后9小时连续黑暗，如此循环，至第7天，调节温度至26°C，光照强度SOOOlux，每天24小时连续光照，没有黑暗，每个瓶子补加蒸馏水500毫升；到第9天，亚心形扁藻细胞密度可达.600万/毫升藻液，球等鞭金藻藻细胞密度可达到1800万/毫升藻液，即可收集藻细胞；步骤3所述的藻细胞进行收集 按重量份配比计取硫酸亚铁，甲壳素，氯化铝各1000g，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过200目筛)，按重量比硫酸亚铁I份，甲壳素3份，氯化铝2份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合均匀，制成复合沉淀剂，取培养了 9天的藻液1000份，加入所述复合沉淀剂0.4份，用空气压缩机连接一塑料管插入藻液充气搅拌、混合15分钟，将藻液置于.5°C冷柜中(保持黑暗)静置、沉淀24小时，由于沉淀剂的沉淀和温度的突然降低，藻细胞迅速休克且下沉到瓶底，弃上清液，取底部粘稠牙膏状藻泥，藻细胞收集完毕。
【专利摘要】本发明公开了一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法，属水产养殖领域。过去海洋微藻常采用光生物反应器或开放水泥池培养，基建投资大，工艺繁杂，技术要求高，易污染，操作麻烦，效率低下。本发明技术特点是：采用两种微藻混合养殖，优势互补，相互促进，减少了资源浪费；采用三角烧瓶串联养殖，通入的气体得到三次利用，节约了能量和资源且不易污染；在培养的早、中、晚期提供不同光照和温度，促进了微藻快速生长和高不饱和脂肪酸大量积累；加入复合沉淀剂后，将藻液置于5℃低温且黑暗环境，收集效率高，营养不散失，操作简单，实用性强。CCTCC M201013820100607
【IPC分类】C12N1-12, C12R1-89
【公开号】CN104593262
【申请号】CN201510002938
【发明人】王培磊
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月6日