专利名称：一种柞蚕卵巢细胞培养基及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及昆虫解剖学、昆虫组织培养学等领域，具体涉及ー种柞蚕卵巢细胞培养基、及其在柞蚕卵巢细胞体外培养技术中的应用。
背景技术：
昆虫细胞培养是从昆虫体内取出细胞，模拟昆虫体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使细胞生存、生长并维持结构和功能的ー门技木。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。20世纪初，许多昆虫学家尝试过使用体外培养的昆虫细胞作为科学研究的工具。最早进行昆虫组织体外培养的是德国Richard Goldschmiedt (1915),他使用惜比古天香(Hyalophora cecropia)蛾的精子进行体外培养，用来观察精子的发育(Goldschmidt and Kaiser，1915)。在20世纪30年代，美国Trager进行了家蚕(Bombyx mori)细胞原代培养,首次研究了昆虫细胞体外生长条件，家蚕细胞在培养基中的体外生存可維持3周。50年代，加拿大Wyatt改进了家蚕卵巢细胞培养条件，成功设计了昆虫细胞培养基IPL-16。60年代，Grace等进ー步改良了昆虫细胞培养基，至今已广泛用于昆虫细胞系的培养与研究。随着细胞生物学和分子生物学的相互滲透，分子生物学实验技术与细胞培养技术的结合，使细胞在阐明基因的结构与功能、基因在细胞生长和分化中的作用等方面发挥了重要的作用。同吋，昆虫细胞培养和分子生物学的应用对于了解昆虫的生理和发育机制，昆虫与真菌、微孢子虫、细菌和病毒在细胞和分子水平的相互作用方面也起了重要作用。2002年钱永华等利用家蚕细胞研究家蚕微孢子虫的形成、生活史和侵染家蚕的过程等。2004年肖仕全利用家蚕胚胎细胞系对家蚕类浓核病毒毒理进行了研究，早在1995年邓宁等利用昆虫细胞大規模培养进行杆状病毒杀虫剂的生产。由此可见，建立昆虫细胞培养方法，对了解昆虫与微孢子虫、细菌和病毒等相互作用关系的ー些理论问题提供了技术手段；同时也为生物防治エ厂化生产昆虫病毒制剂开辟了新途径。昨蚕(Antheraea pernyi)是我国重要的经济昆虫,辽宁是我国的主产区，姆年产量5万吨左右。由于柞蚕以蛹滞育越冬，可长期保存。柞蚕丝除了可以织绸外，还可广泛用于军エ、化工、医药等方面；柞蚕蛹含有大量蛋白质和氨基酸，营养丰富，也是深受人们喜爱的昆虫食品；另外，由于柞蚕蛹、蛾、卵、幼虫等四个不同变态阶段中含有多种生物活性物质，近年来又成为保健品、生物药品等的重要原料；柞蚕蛹或细胞又是近年发展起来的基因工程中得重要的生物反应器，因此，人们对柞蚕的需求越来越多，其经济价值和社会效益也在不断提高。但由于柞蚕放养在野外，经受着各种病毒、细菌、微孢子虫等病原微生物的侵袭，时有病害的发生，导致部分蚕农减产甚至绝收，影响了蚕农放养柞蚕的积极性，严重地阻碍了柞蚕生产的发展，而柞蚕细胞又是研究这些病害发病机理及病原侵染规律必要的工具与平台，因此，开展柞蚕细胞培养方法研究，建立柞蚕卵巢细胞培养方法对发展柞蚕生产及相关研究具有重要意义。
发明内容
为了发展柞蚕生产及相关研究，本实验室已对柞蚕蛹、幼虫的卵巢细胞进行了大量的离体培养试验，与此同时，研发了比较适合该细胞体外生长的培养基配方、培养条件和培养方法。本发明涉及的柞蚕卵巢细胞培养基的配制方法是，将配制好的氨基酸和糖混合贮藏液(MLM-AAS)、无机盐贮藏液(MLM-Salt)、维生素贮藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例混合，并调PH制得MLM-45培养基，用于柞蚕卵巢细胞培养前，加入胎牛血清和青链霉素混合液。通过多种实验确定该细胞体外生长条件为培养温度，pH值及渗透压值，本发明为进行柞蚕生物学、柞蚕病原微生物及相关领域研究提供技术服务。本发明的具体技术方案如下本发明的一方面在于提供一种柞蚕卵巢细胞培养基MLM-45的组成成分，每配制IOOOmL,其具体组成成分及用量如下
5 倍浓缩的 MLM-AAS200 mL
10 倍浓缩的 MLM-Salt100 mL
1000 倍浓缩的 MLM-Vit 1 mL
牛血清白蛋白5.Og
胎球蛋白0.02g分别称取上述组分，加蒸馏水至IOOOmL,调pH6. 2-6. 4，过滤除菌，4°C保存；其中(a)每配制IOOOmL的5倍浓缩的氨基酸和糖混合贮藏液，其具体组成成分及用量
如下
权利要求
1.一种柞蚕卵巢细胞培养基MLM-45，每配制IOOOmL,其具体组成成分及用量如下 .5 倍浓缩的 MLM-AAS200 mL .1O 倍浓缩的 MLM-Salt100 mL .1000 倍浓缩的 MLM-Vit I mL 牛血清白蛋白5.Og 胎球蛋白0.02g分别称取上述组分，加蒸馏水至IOOOmLdM PH6. 2-6. 4，过滤除菌，4°C保存；其中(a)每配制IOOOmL的5倍浓缩的MLM-AAS，其具体组成成分及用量如下5倍浓缩的MLM-AAS成分用量(单位g) L-Cystine0.28 L-Tyrosine0.425 a-Alanine1.55 β-Alanine1.05L-Arginine-HCl3.45 L-Aspartic acid3.75 L-Asparagine3.75 L-Glutamic acid4.5 L-Glutamine4.5 L-Glycine2.3 L-Histidine4.25 L-Isoleucine2.6 L-Leucine0.405 L-Lysine-HCl3.25 L-Methionine2.25L-Phenylalanine3.4 L-Proline1.95 DL-Serine2.65 L-Threonine0.8L-Tryptophan0.425 L-Valine2.5 Glucose12.5 Fructose2.5 Sucrose87.5分别称取上述组分，加蒸馏水至lOOOmL，过滤除菌，_20°C保存；(b)每配制1OOOmL的10倍浓缩的MLM-Salt，其具体组成成分及用量如下
2.根据权利要求I所述的MLM-45培养基，其特征在于用10mol/LKOH调整pH。
3.根据权利要求I所述的MLM-45培养基，其特征在于用O.22 μ m或O. 45 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的MLM-45培养基在培养细胞中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于培养柞蚕卵巢细胞的条件为 使用前，向MLM-45培养基中，按20 %的体积比加入胎牛血清，按I %的体积比加入青链霉素混合液；青链霉素混合液中青霉素、链霉素的浓度均为10，000单位/mL ； 细胞培养温度为26 28°C ; 细胞培养pH为6. 2 6. 4 ; 细胞培养渗透压值为315-350m0sm/kg。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于培养柞蚕卵巢细胞的条件为细胞培养温度为27°C ；细胞培养PH为6. 3 ; 细胞培养渗透压值为325mOsm/kg。
全文摘要
本发明公开一种柞蚕卵巢细胞培养基的组成成分、配制方法及其在柞蚕卵巢细胞培养中的应用。将配制好的氨基酸和糖混合贮藏液(MLM-AAS)、无机盐贮藏液(MLM-Salt)、维生素贮藏液(MLM-Vit)和牛血清白蛋白、胎球蛋白等按一定比例配制，并调pH为6.2-6.4，制得MLM-45培养基，用于柞蚕卵巢细胞培养前，按20％体积比加入胎牛血清和1％体积比的青链霉素混合液。通过多种实验确定该细胞体外生长条件为培养温度26-28℃，pH6.2～6.4；渗透压315-350mOsm/kg。本发明为进行柞蚕生物学、柞蚕病原微生物及相关领域研究提供技术服务。
文档编号C12N5/071GK102618487SQ20121002705
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者岳冬梅, 李树英, 王林美, 范琦 申请人:辽宁省农业科学院大连生物技术研究所