一种抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型治疗金黄色葡萄球菌感染的多克隆抗体，该抗体以金黄色葡萄球菌MntC蛋白作为主要免疫抗原通过免疫新西兰大白兔而获得。本发明提供的新型抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体具有免疫调理作用，能够促进机体细胞吞噬金黄色葡萄球菌，从而达到治疗金葡菌感染的作用。
【专利说明】一种抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种金黄色葡萄球菌治疗性多克隆抗体，属于生物工程及免疫学领 域。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,简称SA)，也称"金葡菌"，是一种革兰 氏染色阳性的球菌，常排列成葡萄串状，并可以产生金黄色的色素，并因此而得名。金葡菌 是导致医院感染和后天免疫性群体感染的最主要原因之一，它能够广泛感染机体，包括从 皮肤炎症、中毒性休克、肺炎到威胁生命的骨髓炎、心内膜炎、败血症等一系列疾病。此外， 金葡菌还能够产生多种毒素，危害人体的健康。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，近年 来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。
[0003] 目前，在临床上多采用联合使用抗生素的方法治疗金黄色葡萄球菌感染，但效果 并不十分理想，而且还加速了耐药性金黄色葡萄球菌的产生。细菌在各种抗生素的选择压 力下，最耐药的菌株存活下来，这种耐药性可以在细菌间传播，耐药细菌又能在全世界范围 内播散，最终导致"超级病菌"一耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA)的出现。治疗MRSA 感染是临床上十分棘手的难题之一。
[0004] SA的生存需要多种金属离子参与其生理过程。这些金属离子的摄取与特定的蛋白 相关，因此，推测这些蛋白产生的特异性抗体能够对治疗与预防金葡菌感染具有重要作用。 Merck公司则选择铁离子决定蛋白IsdB作为疫苗候选组分开展过临床试验。猛离子是在 SA生长过程中起重要作用的金属离子，它能够保护SA免受宿主嗜中性粒细胞的杀伤作用， 并且在SA免疫逃逸过程中也发挥了重要作用。
[0005] 锰离子转运蛋白（Mnt protein)能够使金黄色葡萄球菌抵抗机体的免疫清除作 用，从而使金黄色葡萄球菌能够在动物体内存活并引发一系列的炎症反应。锰离子转运蛋 白是一类功能相近的蛋白组成的复合体，这类复合体包括ATP结合蛋白（MntA)，膜转运蛋 白（MntB)与锰离子结合蛋白（MntC)。其中，对MntC蛋白功能的研究最为透彻。MntC蛋白 存在于金黄色葡萄球菌的表面，动物感染模型显示MntC还参与金黄色葡萄球菌生物膜的 形成。作为MntC的同源蛋白，SitC存在于表皮葡萄球菌中，有研究显示在表皮葡萄球菌小 鼠肾囊肿模型中，被动免疫恢复期兔子抗SitC蛋白的血清能够保护小鼠抵抗表皮葡萄球 菌的攻击。另外，本课题的研究结果也证明MntC能够在不同地区与不同血清型的金黄色葡 萄球菌中高效表达，并且MntC产生的抗体具有广谱调理杀菌作用。
[0006] 本课题利用MntC蛋白开发出一种能够抑制金黄色葡萄球菌感染的多克隆治疗性 抗体，该抗体能够促进宿主免疫系统吞噬清理金葡菌，从而达到有效治疗金葡菌感染的目 的。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的问题是提供一种能够抗金葡菌感染的多克隆治疗性抗体。
[0008] 所述MntC蛋白来自金黄色葡萄球菌，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /Jn 〇
[0009] 本发明还提供一种制备所述MntC蛋白的方法，主要包括以下步骤：（1)合成编码 MntC蛋白的基因序列，在大肠杆菌中进行表达；（2)通过镍柱亲和层析纯化MntC蛋白。
[0010] 优选以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a为表达载体表达MntC蛋白。
[0011] 本发明提供一种由本发明的MntC蛋白产生的多克隆抗体以及所述的多克隆抗体 在预防和治疗SA感染的生物制品中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图 UMntC 基因 PCR 扩增结果，M :Marker DL5000。
[0013] 图 2、重组质粒 pET28a_mntc 的酶切验证，M :Marker DL5000 ;1_3 :pET28a_mntc。
[0014] 图 3、MntC 蛋白纯化结果，FT :flow through ;W1_W3 :wastel_3 ;50mM :50mM 咪唑； IOOmM :IOOmM 咪唑；150mM :150mM 咪唑；200mM :200mM 咪唑；250mM :250mM 咪唑。
[0015] 图4、S. aureus全血生存实验结果，横坐标表示不同地区分离到的金黄色葡萄球 菌，Ctrl为ISA 206 VG佐剂血清对照；纵坐标表示金黄色葡萄球菌的存活率。
[0016] 图5、ELISA检测不同临床分离金黄色葡萄球菌MntC :横坐标表示不同地区分离到 的金黄色葡萄球菌，纵坐标为OD45tl读值。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1表达载体pET28a-mntc的构建
[0018] 以临床分离到的奶牛金黄色葡萄球菌基因组为模板，PCR结果如图1所示，所得 MntC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0019] 1. 1 加样体系为（50 μ 1):
【权利要求】
1. 一种新型金黄色葡萄球菌治疗性多克隆抗体，其特征在于以金黄色葡萄球菌Mntc 重组蛋白作为免疫原，生产抗金黄色葡萄球菌感染的多克隆抗体。
2. 权利要求1所述的治疗性多克隆抗体，其特征在于所述MntC蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
3. 生产权利要求1所述金黄色葡萄球菌治疗性多克隆抗体的制备方法，其特征在于包 括如下步骤： 1) 克隆金黄色葡萄球菌MntC蛋白基因； 2) 将步骤1)中获得的MntC蛋白基因克隆到pET28a ; 3) 将步骤2)获得的表达载体转化E. coli BL21(DE3)，诱导表达获得重组MntC蛋白； 4) 用PBS缓冲液溶解步骤3)获得的重组MntC蛋白，在体系中加入ISA 206 VG佐剂， 乳化后免疫新西兰大白兔。
4. 权利要求1所述MntC蛋白包括天然蛋白与重组蛋白，重组蛋白表达系统包括但不限 于大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞以及昆虫细胞等。
5. 权利要求1所述生产多克隆抗体的动物包括但不限于兔子、小鼠、牛、羊、豚鼠等，其 中优选兔子。
6. 权利要求1所述金黄色葡萄球菌治疗性多克隆抗体在制备用于预防或治疗金黄色 葡萄球菌感染的制剂中的应用。
7. 权利要求1所述金黄色葡萄球菌多克隆抗体与其它药物载体组合构成的新型药物。
【文档编号】C07K14/31GK104211804SQ201410423914
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】钱泓, 吴有强, 覃思, 宣春玲, 车影, 曹珊珊, 张屹峰, 张丽丽, 吴素芳 申请人:钱泓