一种荧光定量pcr检测穿刺巴斯德芽菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及穿刺巴斯德芽菌的定量检测技术领域，特别是涉及一种以单拷贝的spoIIAB基因为靶点的荧光定量PCR检测穿刺巴斯德芽菌的方法。
【背景技术】
[0002]穿刺巴斯德芽菌(Pasteuria penetrans)是一种能够有效的防治根结线虫病害的革兰氏阳性细菌。穿刺巴斯德芽菌通过在线虫体内寄生，完成生长和繁殖过程，同时破坏线虫的组织细胞，导致雌虫不能或极少产卵，大幅降低线虫的虫口密度，从而起到有效防治根结线虫的作用。穿刺巴斯德芽菌的芽胞具有抗高温、高湿、干旱等不良外界环境，及不易受杀线剂影响等优点，并且该菌具有专性寄生植物病原线虫的特性，被认为是极具开发潜力的根结线虫生防因子。
[0003]穿刺巴斯德芽菌广泛分布于世界各地，其芽胞直径约为3 μπι-5 μπι，具有扁球状且高度折光的内生孢子，在光学显微镜下清晰可见，目前国际上对穿刺巴斯德芽菌芽胞的检测普遍采用显微观察法。然而在穿刺巴斯德芽菌的营养生长阶段，菌体结构呈现复杂多变的形态，必须借助电子显微镜才能进行观察，是一项非常耗时、耗力且价格昂贵的工作。此夕卜，免疫荧光检测法也曾用于穿刺巴斯德芽菌的检测，但是由于抗原一一抗体反应的特异性，以及不同菌株、不同生长阶段体表的蛋白种类和数量的变化，限定了该技术的对穿刺巴斯德芽菌的检测。近年来，通过PCR扩增获得穿刺巴斯德芽菌的16S rDNA、sigE、gyrB等基因片段的方法，也被应用于对该菌的检测和鉴定。但是由于该菌的纯培养技术尚未突破，对其基因组的了解十分有限，目前可以用于对该菌进行检测的有效基因片段很少；并且常规PCR只能得到定性的结果，而无法对其在不同环境样品中的数量以及生长过程中的动态变化进行研宄。
[0004]spoIIAB基因编码抗sigma因子的Sp0IIAB蛋白，是芽胞形成过程中的关键基因。该基因不仅具有种内保守、种间差异较大的特点，并且拷贝数恒定，在穿刺巴斯德芽菌基因组中为单拷贝基因。与多拷贝的16S rDNA相比较，以spoIIAB基因为靶点的检测结果更能真实反映目标样品中穿刺巴斯德芽菌的数量。
[0005]本发明拟利用穿刺巴斯德芽菌特异检测靶点spoIIAB基因片段，通过实时荧光定量PCR，建立一种针对该菌的简单、快速、灵敏、特异的定量检测方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供了一种以单拷贝的spoIIAB基因为靶点，利用荧光定量PCR技术快速检测穿刺巴斯德芽菌的方法，用于快速、灵敏的定量检测穿刺巴斯德芽菌在不同环境样品、以及生长过程中的动态变化。
[0007]本发明的方法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性好、可以定量检测等特点。
[0008]本发明通过以下方案予以实现:
[0009](I)对穿刺巴斯德芽菌的芽胞进行破壁:
[0010]破壁的方法是，利用Fastpr印24?核酸提取仪对穿刺巴斯德芽菌的芽胞进行破壁，破壁条件:速度6.0-6.5m/s，时间120-180S ；
[0011](2)提取穿刺巴斯德芽菌的基因组DNA，然后利用spoIIAB基因特异性引物进行PCR得到目的片段，并制作质粒标准品；
[0012]利用穿刺巴斯德芽菌spoIIAB基因特异引物(Schrnidt L.M.，et al.Detect1nof Pasteuria penetrans infect1n in Meloidogyne arenaria race Iin planta bypolymerase chain react1n.FEMS Microb1l Ecol，2004.48 (3):457-64.)进行PCR扩增，获得目的片段。
[0013]引物序列为:
[0014]spoIIAB-F:TCGTGTTTCTGTGGAGAT
[0015]spoIIAB-R: CGCAACGGCTACATTCCT
[0016]PCR扩增体系中，上、下游引物的终浓度为600-900nmo 1/L。
[0017]荧光定量PCR反应程序为:94°C预变性30s，接着进行40个循环，每个循环包括94°C变性 7s、57°C退火 15s、72°C延伸 15s ;最后 94°C lmin、57°C lmin、94°C lmin，读取荧光信号，制作溶解曲线。
[0018](3)标准曲线的绘制及spoIIAB基因特异引物扩增效果检测
[0019]将已知拷贝浓度的质粒标准品以10倍梯度稀释后，进行荧光定量PCR，根据反应结果制作标准曲线，标准曲线斜率为-3.216，线性相关系数R2为0.999，说明该方法建立的标准曲线灵敏度高、重复性好，各点之间成高度线性相关。引物的扩增效率为104.6%，在90%?120%的正常范围内，扩增效果理想。
[0020]此外，利用spoIIAB基因特异引物进行荧光定量PCR，结果显示扩增产物的溶解曲线呈单一特征峰，无非特异性产物和引物二聚体；并且以枯草芽胞杆菌(与穿刺巴斯德芽菌亲缘关系很近)，以及无穿刺巴斯德芽菌的土壤总DNA为对照，均无扩增产物，说明引物特异性良好，以此为基础进行定量是可靠的。
[0021](4)待测样品中穿刺巴斯德芽菌的定量检测及灵敏度评价
[0022]穿刺巴斯德芽菌的定量:利用质粒标准品绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算待测样品中穿刺巴斯德芽菌的含量。
[0023]灵敏度评价:以土壤样品中，最低可检测的穿刺巴斯德芽菌数量为例。将含有12-1O7个的穿刺巴斯德芽菌芽胞液分别加入到不含穿刺巴斯德芽菌的500mg 土壤样品中，利用土壤总DNA提取试剂盒提取土壤样品的DNA。将土壤总DNA溶液稀释至合适的浓度，作为PCR反应的模板，无菌水作为空白对照，以spoIIAB基因为靶点，对含不同浓度梯度芽胞的土壤样品进行荧光定量PCR反应。所产生的溶解曲线均为单一特征峰，且Ct值随芽胞浓度增大而减小；对土壤中样品中芽胞的最低可检测浓度为2个/mg 土壤。
[0024]有益效果
[0025]本发明利用荧光定量PCR技术，对穿刺巴斯德芽菌进行定量检测，具有操作简单、灵敏度高、检测结果准确等优点。spoIIAB基因为单拷贝基因，检测结果更能真实反映目标样品中穿刺巴斯德芽菌的数量；引物的特异性好，扩增效果理想；建立的标准曲线灵敏度高、重复性好，标准曲线各点之间成高度线性，在穿刺巴斯德芽菌定量检测领域具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0026]图1为实施例中对土壤中穿刺巴斯德芽菌的检测结果
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未具体标明实验条件的方法，按照常规实验条件进行，如按照制造厂商建议的条件，或《分子克隆实验指南》(Sambrook，Cold SpringHarbor Laboratory Press)等实验手册提供的条件。
[0028]实施例1
[0029]穿刺巴斯德芽菌DNA的制备及荧光定量PCR检测方法的建立
[0030](I)穿刺巴斯德芽菌的芽胞液的制备及芽胞破壁
[0031]从感染根结线虫的植物病根收集雌虫，将虫体压碎并加入无菌水制成悬浮液，于显微镜(X400)下观察是否有芽胞；将含穿刺巴斯德芽菌芽胞的悬浮液汇集于一管中，充分混勾后，2，000 Xg低速离心lmin，取上清，去除线虫虫体等杂质。
[0032]上清液中加入等体积石英砂(diam.= 0.0lmm)，利用Fastprep24?核酸提取仪对穿刺巴斯德芽菌芽胞进行破壁，破壁条件:速度6.5m/s，时间180s。
[0033](2)基因组DNA的提取及spoIIAB基因引物特异性的验证
[0034]用酚氯仿法提取菌液的基因组DNA，或利用土壤总DNA提取试剂盒提取土壤样品的 DNA。