一种检测污水中亚硝酸盐氧化菌群落结构和丰度的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别是一种检测污水中亚硝酸盐氧化菌群落结构和丰度的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着工业废水和生活污水中氮元素含量的增加，导致湖泊、河口等地表水体富营养化程度加剧，破坏水体生态平衡，为缓解这一过程，降低污水中氮元素含量势在必行。
[0003]目前污水中的氮元素主要通过脱氮微生物降解去除，包括硝化和反硝化过程，其中硝化反应包括氨氧化菌将氨氮氧化为亚硝酸盐氮的过程以及亚硝酸盐氧化菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的过程，亚硝酸盐氧化菌是脱氮的第二个环节，也是反硝化得以实现的前提，污水中亚硝酸盐氧化菌的群落结构和丰度是脱氮系统稳定高效运行的关键性因素，迫切需要检测分析污水生物处理系统中该菌属的群落结构和丰度。
[0004]传统的微生物检测技术中，主要依靠纯培养技术进行特殊菌株分离后检测，该技术应用范围窄，条件苛刻，无法应用于实际污水系统中相关微生物的检测，由于生物脱氮系统中亚硝酸盐氧化菌组成复杂，培养环境要求苛刻，现阶段很难进行亚硝酸盐氧化菌的纯培养，考虑到纯培养技术的局限性，近年来分子生物学技术逐步应用于污水生物处理系统中微生物的检测。目前，分子生物学技术检测污水生物处理系统中亚硝酸盐氧化菌的手段主要有16S rDNA序列片段扩增检测、荧光原位杂交检测技术(FISH)、实时荧光定量PCR技术(real time Q-PCR)等。《一株异养型亚硝酸盐氧化细菌的分离及其降解特性的研宄》(李焱生等，生物技术通报，2010年第5期)中纯化培养了一株异养型亚硝酸盐氧化菌，并对菌株16S rDNA序列片段扩增进行检测鉴定。该文章纯化培养仅培养了某一种细菌，难以覆盖实际环境中所有的亚硝酸盐氧化菌，而本文应用的16S rDNA序列片段扩增检测分析过程偏差较大，难以应用到实际环境中微生物的检测。研宄者目前针对亚硝酸盐氧化菌的定量检测方法主要是FISH技术和Real time Q-PCR技术；专利公开号CN 101348836A，专利名称“一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法”一文中发明了一种FISH技术来检测硝化细菌，该技术操作复杂，步骤繁琐，探针特异性差、要求高，无法全面覆盖亚硝酸盐氧化菌的全部种属。此外，专利公开号CN 103555831 A，专利名称“污水处理厂亚硝酸盐氧化菌焚光定量PCR检测方法” 一文中以QPCR为技术手段，针对亚硝酸盐氧化菌的两个主要种属进行定量检测分析，该定量技术中标准DNA样品制作困难大，标准曲线难以统一，且实验检测成本高，群落结构分析困难，难以大规模应用于实际污水厂相应微生物的群落结构分析和丰度检测。
[0005]Franck Poly 等以 nxrA 功能基因检测硝化菌属(“First explorat1n ofNitrobacterdAysiVj in soils by a PCR cloning-sequencing approach targetingfunct1nal gene nxrA ^ FEMS MICROB1LOGY ECOLOGY，2008 (64):132-140);Michael Pester等以nxrB功能基因检测硝化螺菌“NxrB encoding the betasubunit of nitrite oxidoreductase as funct1nal and phylogenetic marker fornitrite-oxidizing Nitrospiray\ Environmental Microb1logy，(2014) 16 (10)，3055 -3071)，但是将nxrA和nxrB功能基因同时用于检测亚硝酸盐氧化菌仍未见报道。
【发明内容】
[0006]针对解决上述检测分析技术的缺点，本发明提供了一种经济、简单、准确的亚硝酸盐氧化菌群落结构和丰度的检测方法，该方法不仅可以应用于实际污水处理系统中相关微生物的实时监测，还可以在实验室进行相关的微生物检测，本发明是这样实现的:
一种检测污水中亚硝酸盐氧化菌群落结构和丰度的方法，具体步骤如下:
Ca)提取污水中活性污泥的全部基因组DNA ;
(b)以全部基因组DNA为模板，以上游引物序列SEQID N0.1和下游引物序列SEQ IDN0.2进行nxrA基因PCR扩增；
以全部基因组DNA为模板，以上游引物序列SEQ ID N0.3下游引物序列SEQ ID N0.4进行nxrB基因PCR扩增；
(c)以罗氏454焦磷酸测序法分别nxrA基因PCR扩增产物和nxrB基因PCR扩增产物进行测序；
(d)采用Mothur软件分别对nxrA基因PCR扩增产物测序结果和nxrB基因PCR扩增产物测序结果划分操作分类单元；
Ce)选取具有97%相似度的操作分类单元序列与GenBank进行BLASTn比对，根据BLASTn比对结果，选择相似度> 95%的序列，利用MEGA软件分别对nxrA基因和nxrB基因划分系统进化树，即为污水中亚硝酸盐氧化菌的群落结构；
nxrA基因和nxrB基因的不同操作分类单元的相对丰度即为污水中亚硝酸盐氧化菌的丰度。
[0007]本发明中，步骤b所述nxrA基因PCR扩增是指:
反应体系:10Xbuffer 3 μ L，25mmol/L 的 MgCl2L 8 μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0.2 μ L，1mM的dTNPl.4 μ L，浓度均为1mM的正向引物SEQ ID N0.1和反向引物SEQ ID N0.2各
0.3 μ L，20ng/ μ L的DNA模板2 μ L，无菌双蒸水补足至30 μ L ;
反应条件:94°C下变性1min ；94°C 30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，循环35次；72°C下延伸5min。
[0008]本发明中，步骤b所述nxrB基因PCR扩增是指:
反应体系:10 X buffer 3 μ L，25mmol/L 的 MgCl2L 8 μ L，浓度为 5U/μ L 的 Taq 酶 0.2μ L，1mM的dTNPl.4 μ L，浓度均为1mM正向引物SEQ ID N0.3和反向引物SEQ ID N0.4各0.3 μ L，20ng/ μ L的DNA模板2 μ L，无菌双蒸水补足至30 μ L ;
反应条件为:4°C下变性910min ；94°C 30s, 50°C _58°C退火45s，72°C延伸lmin，循环35次；72°C下延伸5min。
[0009]本发明的有益效果在于:以实际污水生物处理系统活性污泥中微生物总DNA为模板，覆盖活性污泥中所有的微生物，检测范围广；亚硝酸盐氧化菌属于硝化菌属和硝化螺菌属，因此本发明分别对功能基因nxrA和nxrB进行扩增污水中亚硝酸盐氧化菌群，特异性强；以罗氏454焦磷酸测序技术对扩增产物进行测序，测序序列全面、准确、快速；本发明能够检测分析亚硝酸盐氧化菌的群落结构和丰度，既可应用于实验室的检测分析，也可以实现对污水厂脱氮效率的实时监测。
【附图说明】
图1为实施例nxrA基因OTUs序列的系统进化分析示意图；
图2为实施例nxrB基因OTUs序列的系统进化分析示意图；
图3为实施例亚硝酸盐氧化菌的群落丰度和分布示意图；
图4为实施例nxrB基因OTUs的丰度示意图。
【具体实施方式】
[0010]实施例1引物设计
根据Poly et al.2008文献中的引物进行优化设计nxrA基因的特异性扩增正反向引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，扩增产物长度为322bp。
[0011]选取GenBank 数据库中登录号为 FP929003.1 的 Ca.Nitrospira defluvii 全基因组中nxrB基因，和其他相似度99%以上的部分nxrB基因序列作为引物设计模板，设置最佳的引物参数，设计特异性引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，nxrB基因的扩增产物长度为506bp。
[0012]nxrA 基因正向引物 SEQ ID N0.1:5’-GGGTACAAGAAGTGCGTGGA-3’ ；nxrA基因反向引物SEQ ID N0.2:
5’-CTTGCCGTGGATCTGGGTC-3’
nxrB 基因正向引物 SEQ ID N0.3:5’ -CAGACCGACGTGTGCGAAAG-3’nxrB 基因反向引物 SEQ ID N0.4:5’ -TCCACAAGGAACGGAAGGTC-3’。
[0013]实施例2污水处理厂好氧池活性污泥中亚硝酸盐氧化菌群落结构和丰度检测 Cl)活性污泥中微生物总DNA的提取
样品取某城市污水处理厂好氧池的活性污泥，采用美国MP B1medicals公司生产的FastDNA 土壤自旋提取试剂盒对活性污泥样品提取总DNA，操作严