一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水污染治理技术，具体涉及一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应 用，是耐盐耐冷氨氧化细菌的驯化与筛选及其固定化方法与应用。
【背景技术】
[0002] 氨氮过高是水体富营养化的主要因素之一，是水污染控制的主要指标。目前国 内外针对氨氮的去除方法主要包括物理方法、化学方法和生物方法。物理方法只能实现 污染物在空间上的位移，不能实现彻底的去除；化学方法快速有效，但由于引进化学药剂， 处理不当会对水体构成二次污染；生物方法利用微生物的代谢将氨氮转化为氮气，实现污 染物的去除，同时不会对环境构成二次污染而被广泛的认可。已有处理氨氮废水的方法 (ZL102001721A)的专利，是在微波场辐照氨氮废水和活性炭的混合液进行脱除氨氮，虽然 去除效率高，但只改变了氨氮的存在形态，没有彻底去除，并且该方法不适用于自然地表水 体。
[0003] 研宄表明，利用微生物降解水体中的氨氮受到诸如盐度、温度等环境条件的影响， 造成降解效率的降低。河口湿地水体中盐度介于淡水和海水之间，高于10%。，被认为是高盐 度水体。水体中盐度过高会破坏微生物细胞的渗透压，破坏微生物的酶系统。同时，低温环 境会影响微生物酶的活性和繁殖速率，抑制对氨氮的去除。目前文献报道氨氧化细菌的最 适生长温度为30°C-35°c，对于北方寒冷地区，特别是诸如辽河湿地这样的面积广阔的自 然湿地，低温条件不利于氨氧化细菌对氨氮的降解。目前已有专利（ZL102268386A)筛选出 一株降解效果好的氨氧化细菌，在温度为30°C的实验室培养条件下该菌株的氨氧化效率可 达90 %，显然该方法筛选出的氨氧化细菌的最佳温度高，不能在低温环境产生较好的去除 效果；即使有耐低温的细菌也往往也无法同时适应高盐度环境。
[0004] 另外，高效菌剂在自然水体中的投加也是一个十分重要的问题。通常的通过培养 驯化获得的高效菌剂投加在固定容积的反应器中，虽然通过改变反应器内的条件能够获得 较好的降解效果，但应用于现场流动态的自然河流中，随着水体的流动，菌剂在水体中冲 散，难以保证足够的停留时间和足够的微生物浓度，因此不能实现较好的去除效果。加上东 北地区的辽河湿地为重要的石油开采区，石油的开采、运输和储存造成的石油泄漏，对微生 物构成毒害作用，又大大的制约了对氨氮的降解。显然提供一种耐盐耐冷氨氧化细菌的驯 化与筛选及其固定化方法是物态环境的急备所需。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种以生物炭球为载体的耐盐耐冷脱氮菌固定化方法，以 克服现有技术存在的问题。
[0006] 本发明首先考虑到位于我国北方的辽河口湿地，常年处于低温状态，与此同时，河 口湿地生态系统是一个咸淡水交汇，盐度偏高，生态环境敏感的复杂生态系统。然而，利用 已有的传统物理、化学和生物方法无法达到较好的修复效果，且治理成本高。所以专门从湿 地的沉积物中筛选、驯化的耐盐耐冷氨氧化细菌处理辽河水体中的氨氮，不但处理效果好、 费用低，而且因地制宜，不但不会对原有的生态环境构成威胁，而且能充分利用本地资源降 低成本。又考虑到在流动态的自然河流中，为了保持降解菌在水体中足够的停留时间和足 够的微生物浓度，以实现高效的去除效果，解决在现场自然水体中的投加的重要问题。首次 提出以生物炭球为载体的脱氮菌固定化技术，在能够保证微生物不被水流冲散和单位体积 的微生物量的同时，对耐盐耐冷氨氧化细菌具有保护作用，实现氨氮的高效去除。
[0007] 因此，本发明首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐和耐冷性 驯化得到耐盐耐冷氨氧化细菌，其次将将制得的生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液 中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球置于与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并 从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶 液中，并放置冰箱4°c交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定 化生物炭球。
[0008] 上述的高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：
[0009] (1)富集培养：称取干重10g_20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基 的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28°C-30°C的条件下震荡培养数天后吸取10mL 至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化 细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH4)2S045. 5g，CaC035. 5g， NaCl2. 0g，MgS040. 5g，K2HP041. 5g，MnS040.Olg，FeS040 . 02g，蒸馏水 1000mL，5%Na2C03调 节pH= 8. 0,121°C灭菌 30min。
[0010] ⑵纯化分离：将上述氨氧化菌富集液按1〇4-1〇〃梯度进行稀释，分别涂布在固体 培养基上，于28°C-30°C培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一固体培养基 上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化 细囷。
[0011] 上述的固体培养基：NH4S042g，NaH2P040. 25g，MgS04 ? 7H20 0? 03g，MnS04 ? 4H20 0? 01g，K2HP040. 75g，NaCl0? 01g，CaC035g，琼脂 20g蒸馏水 1000mL，5%Na2C03调节pH= 7. 2,121°C灭菌 30min。
[0012] 上述的氨氧化细菌的耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：
[0013] (1)耐盐性驯化：将上述分离得到多株纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中 于150r/min-200r/min，28°C-30°C的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液。待上 述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5%的接种量依次 接种于另外的l〇〇mL盐度为5%。、10%。、15%。和20%。的富集培养基中，于15017^11-20017/ min，28°C-30°C的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐氨 氧化细菌；
[0014] (2)耐冷性驯化：将上述筛选出的耐盐氨氧化细菌以富集液与富集培养基5%的 接种量接种到一个1001^盐度为20%。的富集培养基中，依次于25°〇、201：、151：和10°〇， 150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为 耐盐耐冷氨氧化细菌。
[0015] 上述所述生物炭球挂膜方法：将生物炭球置于上述耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中 浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球。
[0016] 上述耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球：将上述挂膜生物炭球与包埋混合液混 合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液，放置冰箱4°C交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐 盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球，上述的包埋混合液是10%聚乙烯醇的水溶液和20% 的湿菌体按体积（10-15) :1的比例混合得到的。
[0017] 上述湿菌体是取50ml-100ml的微生物富集液经5000-8000r/min离心10_15min， 去除上清液后用无菌水清洗多次后得到的。
[0018] 上述的耐盐耐冷氨氧化细菌为已被驯化的Ochrobactrum.sp和Aquamicrobium. sp〇
[0019] 上述的生物炭球的制备方法，包括如下步骤：
[0020] (1)取秸杆洗净，烘干至恒重，将秸杆粉碎过筛得到秸杆粉末，经过马弗炉烧制成 生物炭；
[0021] (2)将上述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.lmol/L的硝酸作为改 性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性一天后， 再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；再将上述的化学改性生物炭置于频 率40Hz的微波清洗仪中微波震荡40min-90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；
[0022] (3)再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目-200目筛得到粘土粉末；
[0023] (4)将上述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为（0. 5-1) :10的比例混合后， 加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温 干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，上述硅酸钠与粘土质量比为3%，碳酸氢 钠与粘土质量比为1.5%。
[0024] 上述的马弗炉的烧制条件皆为：升温速度10°C/min,温度为300°C_400°C和保温 时间180min，恒温干燥条件皆为60°C-80°C条件下干燥8h-12h。
[0025] 上述的耐盐氨氧化细菌应用于高盐条件氨氮污染水体净化，耐盐耐冷氨氧化细菌 应用于低温高盐条件氨氮污染水体净化。
[0026] 上述的挂膜生物炭球应用于低温高盐条件氨氮污染水体净化，上述耐盐耐冷氨氧 化细菌固定化生物炭球应用于低温高盐条件氨氮污染水体净化。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
[0028] 实施例1
[0029] 对东北地区辽河流受污较严重区域进行采样，通过检测氨氮浓度达3. 4mg/L，控制 盐度为10%。，采用以生物炭球为载体的耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法在温度为10°C的 条件下对水体中的氨氮进行静态处理，包括步骤如下：
[0030] 首先，筛选出高效氨氧化细菌：称取干重20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富 集培养基的250mL锥形瓶中，于200r/min，30°C的条件下震荡培养7天后吸取10mL至另一 个富集培养基中，于上述条件震荡培养7天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化菌的浓 度，最终得到氨氧化细菌富集液；为保证筛选出的细菌为氨氧化细菌，取一定量上述氨氧化 细菌富集液于白瓷板上与一定量Griess试剂混合，若生成紫红色络合物即完成检测；为得 到单一的菌落，将上述氨氧化菌富集液按K^-KT7梯度进行稀释，分别涂布在固体培养基 上，于30°C培养3天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌