一种酶菌协同制备菜籽肽的方法
【专利摘要】本发明涉及一种酶菌协同制备菜籽肽的方法，属才菜籽肽制备技术领域。本发明首先对脱脂菜籽粕进行高温加热，除去抗营养因子硫代葡萄糖苷，得到脱脂菜籽粕混合液，再将其与利用混合菌种培养发酵得到混合酶液、明胶等物质混合过滤，得到菜籽粕提取液，最后将其与磁性水凝胶等物质混合，利用CO2超临界进行萃取，即可得到菜籽肽。本发明制备的菜籽肽含盐量低，且不会因为大量色素的存在，而影响产品色泽；且菜籽肽蛋白酶的活性得以提高，提高了20～25％，水解能力达到12％以上。
【专利说明】
一种酶菌协同制备菜籽肽的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种酶菌协同制备菜籽肽的方法，属才菜籽肽制备技术领域。
【背景技术】
[0002]菜籽肽是以菜籽蛋白或菜籽柏作为原材料，通过物理方法、化学方法或酶法处理后所得到的一种小分子蛋白质，其结构较菜籽蛋白更为简单且分子量更小，具有较好的蛋白质功能特性:溶解性、起泡性、乳化性，且与菜籽蛋白的氨基酸组成几乎完全一致，从而更容易被动物体摄入和吸收。
[0003]现有菜籽生物活性肽的制备工艺主要有三种:(I)基因工程方法；(2)化学合成方法；(3)酶解法。其中，酶解法即是以菜籽分离蛋白为原料，利用商业蛋白酶制剂水解菜籽蛋白制备菜籽肽。该方法以菜籽分离蛋白为原料，具有操作简单，产品含量高等优点，但是生产所用酶制剂用量大且价格昂贵，导致生产成本较高，并且由于菜籽柏或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除，影响了蛋白酶的活性，水解程度不高，难以形成大规模工业化生产。且在酶解过程中均加入大量碱液或酸液来调节酶解反应时溶液的酸碱度，且工艺中没有脱盐处理，使成品盐分含量过高;而且，酶解液中含有大量色素类成分，影响成品的色泽。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题:针对酶解法中菜籽柏或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除，影响了蛋白酶的活性，水解程度不高，难以形成大规模工业化生产，同时成品中盐分含量过高的问题，本发明首先对脱脂菜籽柏进行高温加热，除去抗营养因子硫代葡萄糖苷，得到脱脂菜籽柏混合液，再将其与利用混合菌种培养发酵得到混合酶液、明胶等物质混合过滤，得到菜籽柏提取液，最后将其与磁性水凝胶等物质混合，利用CO2超临界进行萃取，即可得到菜籽肽。本发明主要是利用混合酶液中的植酸酶降解抗营养因子中的植酸，漆酶降解抗营养因子中的芥子碱，而明胶则会与抗营养因子中的单宁形成络合物沉淀，通过沉淀去除，最后通过磁性水凝胶进行脱盐，本发明制备的菜籽肽中含盐量低，且菜籽肽中的抗营养因子可以有效的脱除，水解程度高，未影响到蛋白酶的活性。
[0005 ]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
(1)称取200?300g脱脂菜籽柏加入到烧杯中，向烧杯中加入700?800mL去离子水，加热至沸腾，保温I?2h后停止加热，使其自然冷却至室温，得到预处理后的脱脂菜籽柏混合液，备用；
(2)依次称取10?15g蛋白胨、5?1g牛肉膏、10?15g氯化钠、10?20g葡萄糖、3?5g硫酸镁、3?5g硫酸铁、3?5g磷酸氢二钾加入到培养皿中，再加入1000?1200mL去离子水，搅拌10?20min，制成培养基；
(3)依次将2?4株芽孢杆菌、2?4株黑曲霉菌、2?4株杂色云芝菌接种到培养基中，在30?35°C下，用摇床振荡培养72?96h后，将培养液在6000?8000r/min下离心20?30min，弃去上清液，得到混合菌种，备用； (4)向发酵罐中加入依次加入400?500mL质量浓度为12?14%葡萄糖溶液、5?1g马铃薯、5?1g酵母膏、5?1g玉米粉、2?4g氯化钱、2?4g硫酸钱、2?4g磷酸氢二钠，搅拌制成发酵液；
(5)向上述发酵液中加入发酵液质量10?20%步骤(3)备用的混合菌种，搅拌均匀后，在45?55°C下，发酵24?26h，待发酵结束，将发酵产物在6000?8000r/min下离心30?40min，弃去下层杂质，得到混合酶液；
(6)将上述混合酶液加入到烧瓶中，将烧瓶置于水浴锅中，控制温度在40?50°C，再依次加入2?3g纤维素酶、2?3g果胶酶、I?3g半纤维素酶、3?4g明胶，搅拌5?1min后，加入上述步骤(I)备用的预处理后的脱脂菜籽柏混合液，搅拌反应3?4h，待反应结束，将温度升至90?10tC，搅拌20?30min，过滤，得到滤液，即为菜籽柏提取液；
(7)向菜籽柏提取液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝胶，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，再加入外加磁场，从滤液中将磁性水凝胶回收，得到菜籽肽混合液，将菜籽肽混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为25?35MPa，萃取温度为40?50°C，C02的流量为25?35kg/h，萃取20?30min，得到菜籽肽溶液，将菜籽肽溶液进行减压蒸馏至膏状，再置于-20?-10°C真空冷冻干燥器内，干燥5?6h，得到固体粉末，即菜籽肽。
[0006]本发明制备的菜籽肽蛋白质含量达到97%以上，肽含量为82%以上，产品浓度为lmg/mL时，脂质氧化抑制率达到85%以上，A7QQnm为2.12%，金属螯合力达到65%以上。
[0007]本发明与其他方法相比，有益技术效果是:
(1)本发明制备的菜籽肽含盐量低，且不会因为大量色素的存在，而影响产品色泽；
(2)本发明制备的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高，提高了20?25%，且水解能力达到12%以上；
(3)本发明制备步骤简单，所需成本低。
【具体实施方式】
[0008]首先称取200?300g脱脂菜籽柏加入到烧杯中，向烧杯中加入700?800mL去离子水，加热至沸腾，保温I?2h后停止加热，使其自然冷却至室温，得到预处理后的脱脂菜籽柏混合液，备用；依次称取10?15g蛋白胨、5?I Og牛肉膏、10?15g氯化钠、10?20g葡萄糖、3?5g硫酸镁、3?5g硫酸铁、3?5g磷酸氢二钾加入到培养皿中，再加入1000?1200mL去离子水，搅拌10?20min，制成培养基;依次将2?4株芽孢杆菌、2?4株黑曲霉菌、2?4株杂色云芝菌接种到培养基中，在30?35°C下，用摇床振荡培养72?96h后，将培养液在6000?8000r/min下离心20?30min，弃去上清液，得到混合菌种，备用；再向发酵罐中加入依次加入400?500mL质量浓度为12?14%葡萄糖溶液、5?I Og马铃薯、5?1g酵母膏、5?I Og玉米粉、2?4g氯化铵、2?4g硫酸铵、2?4g磷酸氢二钠，搅拌制成发酵液;接着向上述发酵液中加入发酵液质量10?20%备用的混合菌种，搅拌均匀后，在45?55°C下，发酵24?26h，待发酵结束，将发酵产物在6000?8000r/min下离心30?40min，弃去下层杂质，得到混合酶液；将上述混合酶液加入到烧瓶中，将烧瓶置于水浴锅中，控制温度在40?50°C，再依次加入2?3g纤维素酶、2?3g果胶酶、I?3g半纤维素酶、3?4g明胶，搅拌5?1min后，加入上述备用的预处理后的脱脂菜籽柏混合液，搅拌反应3?4h，待反应结束，将温度升至90?100°C，搅拌20?30min，过滤，得到滤液，即为菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝胶，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，再加入外加磁场，从滤液中将磁性水凝胶回收，得到菜籽肽混合液，将菜籽肽混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为25?35MPa，萃取温度为40?50°C，C02的流量为25?35kg/h，萃取20?30min，得到菜籽肽溶液，将菜籽肽溶液进行减压蒸馏至膏状，再置于-20?-10°C真空冷冻干燥器内，干燥5?6h，得到固体粉末，即菜籽肽。
[0009]实例I
首先称取300g脱脂菜籽柏加入到烧杯中，向烧杯中加入800mL去离子水，加热至沸腾，保温2h后停止加热，使其自然冷却至室温，得到预处理后的脱脂菜籽柏混合液，备用；依次称取15g蛋白胨、1g牛肉膏、15g氯化钠、20g葡萄糖、5g硫酸镁、5g硫酸铁、5g磷酸氢二钾加入到培养皿中，再加入1200mL去离子水，搅拌20min，制成培养基;依次将4株芽孢杆菌、4株黑曲霉菌、4株杂色云芝菌接种到培养基中，在35 0C下，用摇床振荡培养96h后，将培养液在8000r/min下离心30min，弃去上清液，得到混合菌种，备用；再向发酵罐中加入依次加入500mL质量浓度为14%葡萄糖溶液、1g马铃薯、1g酵母膏、1g玉米粉、4g氯化钱、4g硫酸钱、4g磷酸氢二钠，搅拌制成发酵液;接着向上述发酵液中加入发酵液质量20%备用的混合菌种，搅拌均匀后，在550C下，发酵26h，待发酵结束，将发酵产物在8000r/min下离心40min，弃去下层杂质，得到混合酶液;将上述混合酶液加入到烧瓶中，将烧瓶置于水浴锅中，控制温度在50°C，再依次加入3g纤维素酶、3g果胶酶、3g半纤维素酶、4g明胶，搅拌1min后，加入上述备用的预处理后的脱脂菜籽柏混合液，搅拌反应4h，待反应结束，将温度升至100°C，搅拌30min，过滤，得到滤液，即为菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入4g活性炭、5g磁性水凝胶，搅拌20min，过滤，得到滤液，再加入外加磁场，从滤液中将磁性水凝胶回收，得到菜籽肽混合液，将菜籽肽混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为35MPa，萃取温度为50°C，CO2的流量为35kg/h，萃取30min，得到菜籽肽溶液，将菜籽肽溶液进行减压蒸馏至膏状，再置于-10°C真空冷冻干燥器内，干燥6h，得到固体粉末，即菜籽肽。经检测，本发明制备的菜籽肽含盐量低，且不会因为大量色素的存在，而影响产品色泽;且本发明制备的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高，提高了 25%，且水解能力达到13%。
[0010]实例2
首先称取200g脱脂菜籽柏加入到烧杯中，向烧杯中加入700mL去离子水，加热至沸腾，保温Ih后停止加热，使其自然冷却至室温，得到预处理后的脱脂菜籽柏混合液，备用；依次称取1g蛋白胨、5g牛肉膏、1g氯化钠、1g葡萄糖、3g硫酸镁、3g硫酸铁、3g磷酸氢二钾加入到培养皿中，再加入100mL去离子水，搅拌lOmin，制成培养基;依次将2株芽孢杆菌、2株黑曲霉菌、2株杂色云芝菌接种到培养基中，在30 °C下，用摇床振荡培养72h后，将培养液在6000r/min下离心20min，弃去上清液，得到混合菌种，备用；再向发酵罐中加入依次加入400mL质量浓度为12%葡萄糖溶液、5g马铃薯、5g酵母膏、5g玉米粉、2g氯化钱、2g硫酸钱、2g磷酸氢二钠，搅拌制成发酵液;接着向上述发酵液中加入发酵液质量10%备用的混合菌种，搅拌均匀后，在450C下，发酵24h，待发酵结束，将发酵产物在6000r/min下离心30min，弃去下层杂质，得到混合酶液;将上述混合酶液加入到烧瓶中，将烧瓶置于水浴锅中，控制温度在40?500C，再依次加入2g纤维素酶、2g果胶酶、Ig半纤维素酶、3g明胶，搅拌5min后，加入上述备用的预处理后的脱脂菜籽柏混合液，搅拌反应3h，待反应结束，将温度升至90°C，搅拌20min，过滤，得到滤液，即为菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入2g活性炭、3g磁性水凝胶，搅拌lOmin，过滤，得到滤液，再加入外加磁场，从滤液中将磁性水凝胶回收，得到菜籽肽混合液，将菜籽肽混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为25MPa，萃取温度为400C，CO2的流量为25kg/h，萃取20min，得到菜籽肽溶液，将菜籽肽溶液进行减压蒸馏至膏状，再置于-20°C真空冷冻干燥器内，干燥5h，得到固体粉末，即菜籽肽。
[0011]本发明制备的菜籽肽含盐量低，且不会因为大量色素的存在，而影响产品色泽;且本发明制备的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高，提高了 20%，且水解能力达到13.2%。
[0012]实例3
首先称取250g脱脂菜籽柏加入到烧杯中，向烧杯中加入750mL去离子水，加热至沸腾，保温Ih后停止加热，使其自然冷却至室温，得到预处理后的脱脂菜籽柏混合液，备用；依次称取12g蛋白胨、7g牛肉膏、12g氯化钠、15g葡萄糖、4g硫酸镁、4g硫酸铁、4g磷酸氢二钾加入到培养皿中，再加入IlOOmL去离子水，搅拌15min，制成培养基;依次将3株芽孢杆菌、3株黑曲霉菌、3株杂色云芝菌接种到培养基中，在33 °C下，用摇床振荡培养80h后，将培养液在7000r/min下离心25min，弃去上清液，得到混合菌种，备用；再向发酵罐中加入依次加入450mL质量浓度为13%葡萄糖溶液、7g马铃薯、8g酵母膏、8g玉米粉、3g氯化钱、3g硫酸钱、3g磷酸氢二钠，搅拌制成发酵液;接着向上述发酵液中加入发酵液质量15%备用的混合菌种，搅拌均匀后，在500C下，发酵25h，待发酵结束，将发酵产物在7000r/min下离心35min，弃去下层杂质，得到混合酶液;将上述混合酶液加入到烧瓶中，将烧瓶置于水浴锅中，控制温度在45°C，再依次加入2g纤维素酶、2g果胶酶、2g半纤维素酶、3g明胶，搅拌7min后，加入上述备用的预处理后的脱脂菜籽柏混合液，搅拌反应3h，待反应结束，将温度升至95°C，搅拌25min，过滤，得到滤液，即为菜籽柏提取液;最后向菜籽柏提取液中依次加入3g活性炭、4g磁性水凝胶，搅拌15min，过滤，得到滤液，再加入外加磁场，从滤液中将磁性水凝胶回收，得到菜籽肽混合液，将菜籽肽混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为30MPa，萃取温度为45°C，CO2的流量为30kg/h，萃取25min，得到菜籽肽溶液，将菜籽肽溶液进行减压蒸馏至膏状，再置于_15°C真空冷冻干燥器内，干燥6h，得到固体粉末，即菜籽肽。
[0013]本发明制备的菜籽肽含盐量低，且不会因为大量色素的存在，而影响产品色泽;且本发明制备的菜籽肽蛋白酶的活性得以提高，提高了 24%，且水解能力达到12.5%。
【主权项】
1.一种酶菌协同制备菜籽肽的方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)称取200?300g脱脂菜籽柏加入到烧杯中，向烧杯中加入700?800mL去离子水，加热至沸腾，保温I?2h后停止加热，使其自然冷却至室温，得到预处理后的脱脂菜籽柏混合液，备用； (2)依次称取10?15g蛋白胨、5?1g牛肉膏、10?15g氯化钠、10?20g葡萄糖、3?5g硫酸镁、3?5g硫酸铁、3?5g磷酸氢二钾加入到培养皿中，再加入1000?1200mL去离子水，搅拌10?20min，制成培养基； (3)依次将2?4株芽孢杆菌、2?4株黑曲霉菌、2?4株杂色云芝菌接种到培养基中，在30?35°C下，用摇床振荡培养72?96h后，将培养液在6000?8000r/min下离心20?30min，弃去上清液，得到混合菌种，备用； (4)向发酵罐中加入依次加入400?500mL质量浓度为12?14%葡萄糖溶液、5?1g马铃薯、5?1g酵母膏、5?1g玉米粉、2?4g氯化钱、2?4g硫酸钱、2?4g磷酸氢二钠，搅拌制成发酵液； (5)向上述发酵液中加入发酵液质量10?20%步骤(3)备用的混合菌种，搅拌均匀后，在45?55°C下，发酵24?26h，待发酵结束，将发酵产物在6000?8000r/min下离心30?40min，弃去下层杂质，得到混合酶液； (6)将上述混合酶液加入到烧瓶中，将烧瓶置于水浴锅中，控制温度在40?50°C，再依次加入2?3g纤维素酶、2?3g果胶酶、I?3g半纤维素酶、3?4g明胶，搅拌5?1min后，加入上述步骤(I)备用的预处理后的脱脂菜籽柏混合液，搅拌反应3?4h，待反应结束，将温度升至90?10tC，搅拌20?30min，过滤，得到滤液，即为菜籽柏提取液； (7)向菜籽柏提取液中依次加入2?4g活性炭、3?5g磁性水凝胶，搅拌10?20min，过滤，得到滤液，再加入外加磁场，从滤液中将磁性水凝胶回收，得到菜籽肽混合液，将菜籽肽混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为25?35MPa，萃取温度为40?50°C，C02的流量为25?35kg/h，萃取20?30min，得到菜籽肽溶液，将菜籽肽溶液进行减压蒸馏至膏状，再置于-20?-10°C真空冷冻干燥器内，干燥5?6h，得到固体粉末，即菜籽肽。
【文档编号】C12R1/685GK105950696SQ201610484298
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】郭舒洋, 薛培龙, 孟浩影
【申请人】郭舒洋