一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇的方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11?氧化?罗汉果醇的方法，属于药物前体或保健品技术领域。该方法包括如下步骤：步骤一：酶水解罗汉果皂苷V；步骤二：smith降解：(1)高碘酸钠氧化开裂；(2)硼氢化钠还原；(3)水解。本发明联用酶水解和氧化裂解两种方法，首先利用酶水解掉罗汉果皂苷V的部分糖残基，降低糖链的复杂度，再用氧化裂解的方法最终制备罗汉果醇和11?氧化?罗汉果醇两种罗汉果皂苷元。本发明的方法，适用于大量样品的制备，产率高，而且可以同时获得罗汉果醇和11?氧化?罗汉果醇两种苷元。
【专利说明】
一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11 -氧化-罗汉果 醇的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇的方 法，属于药物前体或保健品技术领域。
【背景技术】
[0002] 罗汉果是萌芦科藤本植物罗汉果（Siraitia grosvenorii)的果实，具有清热润 肺，利咽开音，滑肠通便的功效。罗汉果的主要有效成分为罗汉果皂苷(mogroside)，成熟罗 汉果主要富含苷元连接5个糖的罗汉果皂苷V(M 〇gr〇Side V)，其甜度为蔗糖的300倍以上， 而热量几乎为零。日本学者研究报道，罗汉果皂苷V有抗促癌作用，可作为癌症的化学预防 剂。其苷元为萌芦烧型的四环三砲罗汉果醇(mogrol)及11-氧化-罗汉果醇（ll-0-mogrol)， 结构式如下所示：
[0004] 本
【申请人】通过前期试验，发现罗汉果皂苷除了少数以一糖苷和二糖苷的形式进入 血液，绝大部分是以苷元的形式进入血液，可见罗汉果皂苷元是其药用活性的物质基础。为 了进一步对其作用机理进行研究并高效的开发利用，需要大量制备罗汉果皂苷元。
[0005] 制备皂苷苷元的方法通常包括:氧化裂解、酸水解以及酶解法，但是直接应用在罗 汉果皂苷上却各自存在不足。传统的氧化裂解方法(smith法）因为氧化剂高碘酸钠与邻羟 基反应后生成碘离子，而碘离子又会与未反应的高碘酸钠发生复杂的氧化还原反应导致氧 化剂大量消耗，因此反应必须在较低的温度下进行以抑制该副反应，对于含有较长或复杂 糖链的底物要达到完全反应所需的时间非常长，不适合大量样品的制备。使用酶水解法，则 因为产物溶解度的原因，只能部分水解罗汉果皂苷的糖链，无法达到获得苷元的目的。酸水 解法则因为对苷元的破坏太强，产率过低同样不适于制备罗汉果皂苷元。
[0006] 鉴于此，有必要开发一种新的方法，来解决现有技术的不足。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉 果醇和11-氧化-罗汉果醇的方法。本发明联用酶水解和氧化裂解两种方法，首先利用酶水 解掉罗汉果皂苷V的部分糖残基，降低糖链的复杂度，再用氧化裂解的方法最终制备罗汉果 醇和11-氧化-罗汉果醇两种罗汉果皂苷元。本发明的方法，适用于大量样品的制备，产率 高，而且可以同时获得罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇两种苷元。
[0008] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉 果醇和11-氧化-罗汉果醇的方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤一:酶水解罗汉果皂苷V
[0010] 取水解酶，溶于水中，所述水解酶与水的质量比例为1:100，取上清液，调节PH=2-6，得到酶解液;取罗汉果皂苷V，采用所述酶解液溶解，所述罗汉果皂苷V与所述酶解液的质 量比例为1:50-100，反应12-24h，加乙醇终止反应，过滤后，得到混合皂苷溶液；
[0011]步骤二：smith 降解 [0012] (1)高碘酸钠氧化开裂
[0013] 在步骤一得到的混合皂苷溶液中，加入混合皂苷溶液体积1-3%的醋酸，搅拌下缓 慢加入高碘酸钠溶液，所述罗汉果皂苷V与所述高碘酸钠摩尔比例为1:2-5,避光在20_80°C 下搅拌反应，得到高碘酸钠氧化开裂后的反应液；
[0014] (2)硼氢化钠还原
[0015] 蒸干步骤（1)得到的高碘酸钠氧化开裂后的反应液，残渣中加入乙醇，过滤溶液， 滤液中缓慢加入硼氢化钠固体，所述罗汉果皂苷V与硼氢化钠的摩尔量比例为1:5-10,搅拌 反应5-12h，得到硼氢化钠还原后的反应液；
[0016] (3)水解
[0017] 在步骤(2)得到的硼氢化钠还原后的反应液中，加入水稀释，所述反应液与水的体 积比例为1:0.5-1:2，加酸调节pH = 1，20-60 °C水浴搅拌2-8h，加碱调节pH=6-7，蒸出乙醇， 用乙酸乙酯萃取，萃取次数多1次，合并乙酸乙酯相，蒸干乙酸乙酯后，采用硅胶柱柱层析分 离，分别得到所述罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇。
[0018] 本发明的方法，适用于大量样品的制备，产率高，而且可以同时获得罗汉果醇和 11-氧化-罗汉果醇两种苷元。
[0019] 本发明的原理：
[0020]步骤一的酶水解罗汉果皂苷V，目的是减少罗汉果皂苷V的葡萄糖残基数量，通常 情况下使混合皂苷中三糖苷成为主要产物有利于随后的反应。
[0021 ]步骤二的Smith反应，包括三步：（1)高碘酸钠氧化葡萄糖残基使之开环；（2)硼氢 化钠还原前一步氧化生成的醛基为醇；（3)酸存在下水解脱除前一步生成的多元醇获得苷 元。其中第一步氧化裂解是整个反应的关键步骤，葡萄糖氧化开环的程度决定了整个反应 的产率。
[0022]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0023]进一步，步骤一中，所述pH调节的方式为柠檬酸、醋酸、磷酸中的一种。
[0024]采用上述进一步的有益效果是:有利于对罗汉果皂苷V的水解。
[0025] 进一步，步骤一所得混合皂苷溶液经HPLC检测，混合皂苷溶液中的罗汉果皂苷V含 量多30%，则重复步骤一，直到混合皂苷溶液中的罗汉果皂苷V含量〈30%。
[0026]采用上述进一步的有益效果是:可以尽可能降低皂苷中糖残基的含量，有利于后 续步骤的反应。
[0027]进一步，步骤二(3)中，所述反应液与水的体积比例为1: 1。
[0028]进一步，步骤二(3)中，步骤二(3)中，所述加酸调节pH的方式为盐酸或硫酸。
[0029] 进一步，步骤二(3)中，所述加碱调节pH的方式为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾或氢氧 化钠中的一种。
[0030] 进一步，步骤二(3)中，所述乙酸乙酯萃取的次数为3次。
[0031] 进一步，步骤二(3)中，所述硅胶柱层析中展开剂为体积比8:1-2:1的二氯甲烷和 乙酸乙酯的混合物。
[0032] 采用上述进一步的有益效果是:可以获得不同纯度及组成的两种皂苷元产品。 [0033]本发明的有益效果是：
[0034] 1.本发明联用酶水解和氧化裂解两种方法，首先利用酶水解掉罗汉果皂苷V的部 分糖残基，降低糖链的复杂度，再用氧化裂解的方法最终制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇两种罗汉果皂苷元。本发明的方法，适用于大量样品的制备，产率高，而且可以同时获得 罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇两种苷元。
[0035] 2.本发明的制备方法条件温和，极大的保留了苷元的化学完整性，副产物少，尤其 适合制备天然丰度很低其它方法难以制备的11-氧化-罗汉果醇。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发 明，并非用于限定本发明的范围。
[0037] 实施例1
[0038]本实施例的酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇的方法，包 括如下步骤：
[0039] 步骤一:酶水解罗汉果皂苷V
[0040] 取6g水解酶，溶于600mL水中，取上清液，用醋酸调节pH= 2，得到酶解液;取6g罗汉 果皂苷V，采用50mL的上述酶解液溶解，反应24h，加乙醇终止反应，过滤后，得到150mL混合 皂苷溶液；
[0041 ]步骤二：smith 降解 [0042] (1)高碘酸钠氧化开裂
[0043]在步骤一得到的混合皂苷溶液中，加入lmL醋酸，搅拌下缓慢50mL高碘酸钠溶液， 避光在20°C下搅拌反应，得到高碘酸钠氧化开裂后的反应液；
[0044] (2)硼氢化钠还原
[0045]蒸干步骤（1)得到的高碘酸钠氧化开裂后的反应液，残渣中加入1 OOmL乙醇，过滤 溶液，滤液中缓慢加lg硼氢化钠固体，搅拌反应5h，得到硼氢化钠还原后的反应液；
[0046] (3)水解
[0047] 在步骤(2)得到的硼氢化钠还原后的反应液，加入50mL的水稀释，加盐酸调节pH = 1，20°C水浴搅拌8h，加碳酸钾调节pH=6,蒸出乙醇，用乙酸乙酯萃取1次，合并乙酸乙酯相， 蒸干乙酸乙酯后，硅胶柱柱层析分离，所述硅胶柱层析中展开剂为体积比8:1的二氯甲烷和 乙酸乙酯的混合物，即分别得到所述罗汉果醇1.45g和11-氧化-罗汉果醇0.41g。
[0048] 实施例2
[0049] 本实施例的酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇的方法，包 括如下步骤：
[0050] 步骤一:酶水解罗汉果皂苷V
[00511 取l0g水解酶，溶于l000mL水中，取上清液，用柠檬酸调节pH=4，得到酶解液；取 100g商品罗汉果皂苷V(50%含量），采用1000mL的上述酶解液溶解，反应18h，加乙醇终止反 应，过滤后，得到2000mL混合皂苷溶液；
[0052]步骤二：smith 降解 [0053] (1)高碘酸钠氧化开裂
[0054]在步骤一得到的混合皂苷溶液中，加入20mL醋酸，搅拌下缓慢400mL高碘酸钠溶 液，避光在50°C下搅拌反应，得到高碘酸钠氧化开裂后的反应液；
[0055] (2)硼氢化钠还原
[0056]蒸干步骤(1)得到的高碘酸钠氧化开裂后的反应液，残渣中加入1 OOOrnL乙醇，过滤 溶液，滤液中缓慢加入40g硼氢化钠固体，搅拌反应8h，得到硼氢化钠还原后的反应液；
[0057] (3)水解
[0058] 在步骤(2)得到的硼氢化钠还原后的反应液，加入2000mL的水稀释，加盐酸调节pH =1，50 °C水浴搅拌5h，加碳酸钠调节pH= 7，蒸出乙醇，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯 相，蒸干乙酸乙酯后，硅胶柱柱层析分离，所述硅胶柱层析中展开剂为体积比5:1的二氯甲 烷和乙酸乙酯的混合物，即分别得到所述罗汉果醇16g和11-氧化-罗汉果醇5.8g。
[0059] 实施例3
[0060] 本实施例的酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇的方法，包 括如下步骤：
[0061 ] 步骤一:酶水解罗汉果皂苷V
[0062] 取30g水解酶，溶于3000mL水中，取上清液，用磷酸调节pH=6，得到酶解液;取500g 商品罗汉果皂苷V(50%含量），采用3000mL的上述酶解液溶解，反应12h，加乙醇终止反应， 过滤后，得到5000mL混合皂苷溶液，经HPLC检测发现溶液中罗汉果皂苷V相对含量为38 %， 蒸干溶剂，再次以3000mL酶解液溶解反应8小时，加乙醇终止反应，过滤后，得到6000mL混合 皂苷溶液；
[0063]步骤二：smith 降解 [0064] (1)高碘酸钠氧化开裂
[0065]在步骤一得到的混合皂苷溶液中，加入150mL醋酸，搅拌下缓慢2000mL高碘酸钠溶 液，避光在50°C下搅拌反应，得到高碘酸钠氧化开裂后的反应液；
[0066] (2)硼氢化钠还原
[0067]蒸干步骤（1)得到的高碘酸钠氧化开裂后的反应液，残渣中加入5000mL乙醇，过滤 溶液，滤液中缓慢加入200g硼氢化钠固体，搅拌反应12h，得到硼氢化钠还原后的反应液； [0068] ( 3)水解
[0069] 在步骤(2)得到的硼氢化钠还原后的反应液，加入5000mL的水稀释，加硫酸调节pH =1，50 °C水浴搅拌5h，加氢氧化钾调节pH = 7，蒸出乙醇，用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙 酯相，蒸干乙酸乙酯后，硅胶柱柱层析分离，所述硅胶柱层析中展开剂为体积比2:1的二氯 甲烷和乙酸乙酯的混合物，即分别得到所述罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇混合产品198g。
[0070] 对比例
[0071] 以现有技术中的酸水解为对比例
[0072] 酸水解是制备三萜皂苷苷元最常用的方法，由于与酶水解相同，受到一糖苷水溶 性的限制，反应必须选择在水/醇体系中进行，本
【申请人】考察了不同酸水解条件对罗汉果醇 (11-氧化-罗汉果醇天然丰度太低，多个样品未能检出，因此没有列出）产率的影响，如表1 所示：
[0073]表1不同条件下的酸水解
[0074]
[0075] 由表1可见，以强酸水解罗汉果皂苷产率较低，无法达到制备苷元的要求，这是由 于苷元上同时存在一个叔羟基和三个仲羟基，在酸性条件下容易被活化而引起一系列的副 反应所致。由此可见，酸水解法不仅产率极低，而且无法用于制备11-氧化-罗汉果醇。
[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇的方法，其特征在 于，包括如下步骤： 步骤一:酶水解罗汉果皂苷V 取水解酶，溶于水中，所述水解酶与水的质量比例为1:100,取上清液，调节pH=2-6,得 到酶解液;取罗汉果皂苷V，采用所述酶解液溶解，所述罗汉果皂苷V与所述酶解液的质量比 例为1:50-100，反应12-24h，加乙醇终止反应，过滤后，得到混合皂苷溶液； 步骤二:smith降解 (1) 高碘酸钠氧化开裂 在步骤一得到的混合皂苷溶液中，加入混合皂苷溶液体积1-3%的醋酸，搅拌下缓慢加 入高碘酸钠溶液，所述罗汉果皂苷V与所述高碘酸钠摩尔比例为1:2-5，避光在20-80 °C下搅 拌反应，得到高碘酸钠氧化开裂后的反应液； (2) 硼氢化钠还原 蒸干步骤（1)得到的高碘酸钠氧化开裂后的反应液，残渣中加入乙醇，过滤溶液，滤液 中缓慢加入硼氢化钠固体，所述罗汉果皂苷V与硼氢化钠的摩尔量比例为1:5-10,搅拌反应 5-12h，得到硼氢化钠还原后的反应液； (3) 水解 在步骤(2)得到的硼氢化钠还原后的反应液中，加入水稀释，所述反应液与水的体积比 例为1:0.5-1:2，加酸调节pH = 1，20-60°C水浴搅拌2-8h，加碱调节pH=6-7，蒸出乙醇，用乙 酸乙酯萃取，萃取次数多1次，合并乙酸乙酯相，蒸干乙酸乙酯后，采用硅胶柱柱层析分离， 分别得到所述罗汉果醇和11-氧化-罗汉果醇。2. 根据权利要求1所述的一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇的方法，其特征在于，步骤一中，所述PH调节的方式为柠檬酸、醋酸、磷酸中的一种。3. 根据权利要求1所述的一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇的方法，其特征在于，步骤一所得混合皂苷溶液经HPLC检测，混合皂苷溶液中的罗汉果皂 苷V含量多30%，则重复步骤一，直到混合皂苷溶液中的罗汉果皂苷V含量〈30%。4. 根据权利要求1所述的一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇的方法，其特征在于，步骤二(3)中，所述反应液与水的体积比例为1:1。5. 根据权利要求1所述的一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇的方法，其特征在于，步骤二(3)中，所述加酸调节pH的方式为盐酸或硫酸。6. 根据权利要求1所述的一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇的方法，其特征在于，步骤二(3)中，所述加碱调节pH的方式为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾 或氢氧化钠中的一种。7. 根据权利要求1所述的一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇的方法，其特征在于，步骤二(3)中，所述乙酸乙酯萃取的次数为3次。8. 根据权利要求1所述的一种酶水解与氧化裂解联用制备罗汉果醇和11-氧化-罗汉果 醇的方法，其特征在于，步骤二(3)中，所述硅胶柱层析中展开剂为体积比8:1-2:1的二氯甲 烷和乙酸乙酯的混合物。
【文档编号】C12P33/00GK105950695SQ201610521201
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】王磊, 李炳辰, 羊学荣, 符毓夏, 李典鹏
【申请人】广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所