肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、制备方法及用途
【专利摘要】本发明公开一种肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、制备方法及用途，小片断基因表达蛋白如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列；制备方法按如下步骤进行：提取肺炎链球菌（ATCC49619）基因组DNA；以所得到的DNA为模板，以具有BamHI和HindIII两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；将切胶回收的PCR反应产物与克隆载体相接，构建克隆质粒；分别用BamHI和HindIII双酶切所构建的克隆质粒，切胶回收500bp小片段，用连接酶与表达载体连接，再转化到感受态细胞，挑取单个克隆培养后，构建重组表达质粒并进行IPTG诱导表达及回收纯化蛋白，其用途是在制备抗菌药物中的应用。
【专利说明】肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、制备方法及用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白、制备方法及用途，尤 其是一种制备简单、成本低、副作用小的肺炎链球菌ATCC49619株自溶素（N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA)小片段基因的原核表达蛋白、制备方法及在制备抗菌药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎链球菌自溶素（N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA)是肺炎链球菌细胞壁 降解酶之一，全段蛋白约为56 kD。目前，LytA全蛋白主要应用于肺炎链球菌的疫苗靶点以 及血清学诊断的抗原，而要获得LytA全蛋白，通常需要经过如下两个步骤：首先通过原核 表达、镍柱纯化的方式得到具有组氨酸接头并结合有硫氧还原蛋白的融合蛋白；然后再切 除硫氧还原蛋白及组氨酸接头。制备LytA全蛋白不仅操作复杂、成本高，而且LytA全蛋白 中只有部分功能团发挥作用，其余部分有可能引起机体的副反应或者增加空间位阻。
【发明内容】
[0003] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种制备简单、成本低、 副作用小的肺炎链球菌ATCC49619株自溶素（N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA)小片 段基因的原核表达蛋白、制备方法及在制备抗菌药物中的应用。
[0004] 本发明的技术解决方案是：一种肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白，其特征 在于如SEQ ID N0 :5所示的氨基酸序列。
[0005] -种上述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的制备方法，其特征在于按如下 步骤进行： a. 提取肺炎链球菌（ATCC49619)基因组DNA ; b. 以得到的DNA为模板，以具有fe?HI和班Will两个酶切位点的PCR反应引物进行 PCR反应；所述PCR反应引物序列如下： 上游引物fe?HI : 5，-GGG 似KATGGAAATTAATGTGAGT-3， 下游引物"ifli/III : 5 ^GGGA^CT7TTTTACTGTAATCAAGCCATC-3、 c. 将切胶回收的PCR反应产物与克隆载体相接，构建克隆质粒； d. 分别用及和历ii/III双酶切所构建的克隆质粒，切胶回收500bp小片段，用连 接酶与表达载体连接，再转化到感受态细胞，挑取单个克隆培养后，构建重组表达质粒； e. 将所构建的重组表达质粒转化到感受态细胞，提取阳性克隆并将所得阳性克隆进 行IPTG诱导表达； f. 4°C离心收集经IPTG诱导表达的菌体，加入裂解液超声破碎，4°C离心收集上清，用 透析袋等电点洗脱法回收纯化蛋白。
[0006] -种上述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的用途，其特征在于在制备抗菌 药物中的应用 GeneBank中没有公布肺炎链球菌菌株(ATCC49619)自溶素序列，相比于目前基因 库中公布的其他肺炎链球菌菌株序列，肺炎链球菌菌株(ATCC49619)自溶素序列中新出 现个汉3?HI的酶切位点。本发明以GenBank中肺炎链球菌M66菌株自溶素基因全序列 (FN549899. 1)设计上下游引物，以肺炎链球菌菌株（ATCC49619) DNA为模板进行PCR反应， 扩增自溶素序列，以PCR反应产物构建的克隆载体用常规的两种酶SaMlI和Λ?/^ΙΙΙ双酶 切后，目的基因出现两个小片度，以其中的约500bp小片段构建重组表达载体，经IPTG诱导 后，采用等电点洗脱法可直接获取了一个新的小片段基因蛋白。PAGE电泳显示该小片段基 因蛋白分子量约为20 kD，结合序列测定及质谱测定结果，证明该小片段基因蛋白不含有现 有全蛋白表达所带的硫氧还原蛋白，只需等电点洗脱纯化，无需进一步切除硫氧还原蛋白 及组氨酸接头，操作简单、成本低。如以合成多肽的方式来获得这段蛋白，则因小片段多肽 氨基酸数量少，合成费用（合成多肽是以氨基酸数量计费）也远低于全片段蛋白。实验表明 本发明的小片断基因蛋白对肺炎链球菌株发挥了溶菌效应，可与全蛋白具有相同的抑菌效 果，避免功能团其余部分有可能引起机体的副反应或者增加空间位阻。
【专利附图】
【附图说明】
[0007] 图1是本发明实施例PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
[0008] 图2、图3是本发明实施例重组克隆质粒PGM_T/7_fM测序结果图。
[0009] 图4是本发明实施例重组克隆质粒PGM-T/7_fM双酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定图。
[0010] 图5是本发明实施例重组表达质粒pET-32a ( + ) / 7双酶切后经1%琼脂糖 凝胶电泳鉴定图。
[0011] 图6本发明实施例重组表达质粒pET-32a ( + )/ 7测序结果图。
[0012] 图7是本发明实施例重组克隆质粒PGM-T/7_fM经IPTG诱导后经1%琼脂糖凝胶 电泳鉴定图。
[0013] 图8是本发明实施例纯化产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
[0014] 图9是本发明实施例纯化产物离子阱质谱图。
【具体实施方式】
[0015] a.提取肺炎链球菌（ATCC49619)基因组DNA; b.以GennBank中肺炎链球菌M66菌株基因全序列（FN549899. 1)，设计上下游引 物：P1 为 5'-GGG6^7iXATGGAAATTAATGTGAGT-3'，P2 为 5'-GGGA^CT7TTTTACTGTAATCAAGCC ATC-3、斜体部分为引入的和沒酶切位点； 以得到的DNA为模板，以上述具有汉3?HI和历ii/III两个酶切位点的PCR反应引物进 行PCR反应扩增目的片段，PCR反应条件95°C 4min ;95°C 30s、56°C 30s、72°C lmin、30个循 环；72°C 7min ;反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 (如图1所示)，切胶回收950bp PCR反应产物； 图1中M :2000 Marker ;1 :阴性对照；2、3 :目的基因；950bp处可见特异性条带，与预期 结果（956bp)相符； c. 将切胶回收的PCR反应产物与克隆载体相接，构建克隆质粒PGM-T/7_Fi儿测序由 TaKaRa公司完成； 重组克隆质粒PGM-T/ 测序结果与GenBank中M66菌株的基因序列符合率为98%， 不同之处主要位于444bp?466bp，如图2所示ATCC49619菌株新增了一个汉3?HI酶切位点 iGGATCC)； d. 分别用feMlI和班/7?/ΙΙΙ双酶切所构建的克隆质粒PGM-T/妙认之后经1%琼脂 糖凝胶电泳，结果如图4所示，图4中Μ: 10000 Marker ; 1 :重组质粒②；2 :重组质粒②经 BamHI和Hindlll双酶切，酶切成的三个片段中居中的片段即为7 ;切胶回收三段中居 中的约500bp小片段，用连接酶与表达载体pET-32a ( + )连接，再转化到感受态细胞凡 DH5a，于LB/Amp平板上挑取单个克隆培养后，构建重组表达质粒pET-32a ( + )/ 7，抽 提质粒进行双酶切鉴定(如图5)并再次测序(如图6所示)，； 图 5 中 M: 10000 Marker ;1 :pET-32a ;2 :pET-32a 经 BamHI 和 Hindlll 双酶切；3 :重组 表达质粒 pET32a ( + ) ' ；4 :pET32a ( + ) ' 经 BamHI 和 Hindlll 双酶切； 序列测定结果如图6,显示该片段基因与肺炎链球菌ATCC49619菌株的克隆质粒 PGM-T/7_fM相应部分符合率为100%，未出现变异； e. 将鉴定正确的重组表达质粒转化至感受态细胞凡coB BL21(DE3)，涂布于LB/Amp 平板，筛选阳性克隆接种于LB/Amp液体培养基，37°C培养至对数生长期（A_值为0. 6? 0· 8)，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，25°C诱导4h ; 诱导产物经1%琼脂糖凝胶电泳如图7所示，图中Μ :蛋白质标准；1 :pET32a( + )/7_FM 7 转化菌经IPTG诱导后的蛋白质表达产物；2 :pET32a ( + )/7_fM 7转化菌的蛋白质表达产 物；3 :pET-32a空载体转化菌经IPTG诱导后的蛋白质表达产物；4 :pET-32a空载体转化菌 的蛋白质表达产物；5 :大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后的蛋白质表达产物；6 :大肠杆菌 BL21(DE3)的蛋白质表达产物。表明小片段自溶素的重组表达质粒pET-32a ( + )/妙Μ 7 经IPTG诱导后，在相对分子质量(笔）约20kD处有明显的蛋白表达条带； f. 4°C离心收集菌体，加入裂解液超声破碎，4°C离心收集上清，用透析袋等电点洗脱 法回收纯化蛋白LytA 7。
[0016] 回收纯化蛋白LytA 7电泳如图8所示，图中Μ :蛋白质标准；1 :不含硫氧还原蛋白 的LytA7 ;2:全段蛋白LytA，表明为单一蛋白条带。
[0017] 离子阱质谱图如图9所示：分析证实所得蛋白LytA 7相对分子量19. 5kD，非硫氧 还原蛋白。
[0018] 蛋白LytA 7测序结果，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0019] 体外抗菌效应实验： 参照CLSI标准，采用微量肉汤稀释法测定本发明实施例所得LytA z及青霉素 G的 MIC，以测得MIC的3倍浓度进行体外抗菌试验，35°C孵育lh，3h，5h和7h后每孔取样2 μ 1 分别做平板菌落计数。
[0020] 实验结果： 自作用于细菌3h开始，LytA ζ开始发挥抑菌效应，细菌数相比于对照组减少，差异有 统计学意义，作用持续到7h观察点。3h和5h时间点抑菌效果与青霉素相比，无显著性差 异，但是7h时抑菌效果强于青霉素 Μ〈 0.05)。证实了小片段LytAZ对肺炎链球菌具有 与青霉素 G相似的溶菌作用，而且溶菌效果持续时间比青霉素 G长。具体如下表：
【权利要求】
1. 一种肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白，其特征在于如SEQ ID NO :5所示的氨 基酸序列。
2. -种如权利要求1所述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的制备方法，其特征 在于按如下步骤进行： a. 提取肺炎链球菌（ATCC49619)基因组DNA ; b. 以所得到的DNA为模板，以具有fe?HI和班WIII两个酶切位点的PCR反应引物进 行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下： 上游引物fe?HI : 5，-GGG 似KATGGAAATTAATGTGAGT-3， 下游引物"ifli/III : 5 ^GGGA^CT7TTTTACTGTAATCAAGCCATC-3、 c. 将切胶回收的PCR反应产物与克隆载体相接，构建克隆质粒； d. 分别用及和历ii/III双酶切所构建的克隆质粒，切胶回收500bp小片段，用连 接酶与表达载体连接，再转化到感受态细胞，挑取单个克隆培养后，构建重组表达质粒； e. 将所构建的重组表达质粒转化到感受态细胞，提取阳性克隆并将所得阳性克隆进 行IPTG诱导表达； f. 4°C离心收集经IPTG诱导表达的菌体，加入裂解液超声破碎，4°C离心收集上清，用 透析袋等电点洗脱法回收纯化蛋白。
3. -种如权利要求1所述肺炎链球菌自溶素小片断基因表达蛋白的用途，其特征在于 在制备抗菌药物中的应用。
【文档编号】A61K38/16GK104152467SQ201410352085
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】罗红, 殷素岚, 邹琴, 孙文平, 杨光, 谢兴凤, 周杰, 吕明睿, 刘科芳 申请人:大连医科大学