预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，包括PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D，其中，所述各组分的含量均为10-100μg/ml；通过向铝佐剂中加入相应剂量的PspA-mRX1、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四种原液并混匀制得；所述免疫原性组合物可以预防覆盖95％以上临床上流行的肺炎链球菌的感染和侵袭，在肺炎预防方面具有广泛应用，其制备方法简单，生产成本较低，生产周期缩短，适合规模化工业生产的需要。
【专利说明】预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，尤其是预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肺炎链球菌是世界范围内引起死亡的重要原因之一，且是肺炎、脑膜炎、中耳炎等 侵袭性和非侵袭性感染的重要致病菌。肺炎链球菌常寄生在健康人的鼻咽部，约有40% - 70%的人带菌，当机体免疫功能降低时，病菌就会乘虚而入侵入肺部，造成肺炎。肺炎链球 菌感染，一是来自自身带菌，当抵抗力降低时，肺炎链球菌向下呼吸道侵犯引起肺炎；二是 被来自带菌的别人或患者所传染，引起肺炎。
[0003] 接种疫苗是有效的特异性预防措施，具有极佳的卫生经济学价值。目前普遍应用 的预防肺炎链球菌疾病的疫苗主要有两类，多糖疫苗（23价多糖疫苗，适用于2岁以上适合 人群）和多糖蛋白结合疫苗（7价、10价或13价，可用于2岁以下婴幼儿）。
[0004] 肺炎多糖疫苗为"23价肺炎多糖疫苗"，能覆盖23种经常引起肺炎球菌感染的血 清型，约90%的肺炎球菌感染疾病是由这23种血清型引起的。绝大多数健康的成年人，在 接种后2-3周内，均能产生抵抗所有或大部分肺炎链球菌的保护性抗体。23价肺炎疫苗可 以有效地预防肺炎，已经在美国、加拿大等30多个国家及地区应用14年以上，接种后保护 率可达92%，具有良好的安全性，免疫功效可维持5年。2岁以上体弱或反复患肺炎的幼儿 及高危人群（如无脾儿童）可以使用。
[0005] 23价肺炎多糖疫苗所含的荚膜多糖抗原为T细胞非依赖性抗原，可以刺激成熟的 B淋巴细胞，但不会刺激T淋巴细胞，此抗原介导的免疫反应持续时间较短，不能产生免疫 记忆。2岁以下婴幼儿免疫功能发育尚不完善，对T细胞非依赖性抗原的反应很差，所以多 糖疫苗不能诱导婴幼儿产生保护性免疫应答。23价肺炎多糖疫苗不能用于2岁以下儿童 的预防。7价肺炎多糖蛋白结合疫苗可以预防疫苗所覆盖7种血清型肺炎链球菌所引起的 疾病，国外研究显示，其所包含的7种血清型所导致的疾病约占所有肺炎链球菌感染疾病 的80%左右。2006-2007年在我国四所有代表性的儿童医院（北京儿童医院、上海复旦大 学附属儿科医院、广州儿童医院和深圳儿童医院）5岁以下住院肺炎儿童中临床分离到279 株肺炎链球菌。分析发现主要的致病肺炎链球菌血清型与PCV7所覆盖血清型一致，而这7 种血清型占到所有致病肺炎链球菌的81 %。这说明7价肺炎结合疫苗在中国同样具有较高 的血清型覆盖率。但7价肺炎结合疫苗不能预防疫苗覆盖这7种血清型之外的其他血清型 肺炎链球菌的感染。研究表明，其它血清型肺炎链球菌的感染也普遍存在。
[0006] 肺炎链球菌表面的多种膜蛋白是重要的毒力因子，可作为一种重要的抗原物质， 由于外膜蛋白具有保守的组成结构，因此外膜蛋白可诱发交叉免疫作用。肺炎表面蛋白 A(PspA)广泛存在于90种肺炎链球菌亚型中,PspA蛋白的a螺旋端是一个重要的抗原决定 区域，在不同血清型中有广泛的同源性，根据该端氨基酸序列，PspA蛋白被划分为3个家族 (famlily)，再细分为6个支系（clade)。
[0007] 已有大量的研究报道了 PspA蛋白对不同血清型SPN的保护作用，将PspA蛋白作 为疫苗成分，可克服多糖蛋白结合疫苗荚膜血清型数量有限且抗蛋白载体抗体对病原菌缺 乏特异性保护作用的不足之处。流行性病学调查显示，绝大多数SPN菌PspA属于一、二两 家族，临床上很少分离到家族三菌株。本发明所述免疫原性组合物PspA-mRXl来自家族 一、PspA-EF5668和PspA-EF3296来自于PspA家族二，以此免疫组合物作为抗原组分，将覆 盖95%以上的临床分离株血清型。
[0008] 溶血素的主要作用是溶血和激活补体，鼻腔和腹膜腔的肺炎链球菌攻击试验证 实，重组Ply可使老鼠的寿命延长89%和93%。ply氨基酸序列高度保守，抗原性强，因此， Ply可以作为覆盖所有血清型抗原疫苗的备选蛋白，该蛋白的疫苗潜能已经在不同的实验 室中证实。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原 性组合物。
[0010] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述预防肺炎链球菌感染性疾病的免 疫原性组合物的制备方法。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0012] 一种用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物（PBPV制剂），包括 PspA-mRXl (去除人同源性的RXl亚型肺炎球菌表面蛋白A)、PspA-EF5668(EF5668亚型肺 炎球菌表面蛋白A)、PspA-EF3296(EF3296亚型肺炎球菌表面蛋白A)和PlyL460D(改造的 肺炎链球菌溶血素），其中，所述PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D的含量 均为10-100 μ g/ml，即该免疫原性组合物的组分剂量配制方案为：
[0013] (I) PspA-mRXl 用量 10-100 μ g/ml ;
[0014] (2) PspA-EF5668 用的量 10-100 μ g/ml ;
[0015] (3) PspA-EF3296 用量 10-100 μ g/ml ;
[0016] (4) PlyL460D 用量 10-100 μ g/ml。
[0017] 优选的，上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，所述 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D 的质量比为 1:1:1:1。
[0018] 优选的，上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，所述PspA-mRXl 是根据申请号为201110455047. 3的发明专利制备得到的。
[0019] 优选的，上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，可以作为预防 肺炎链球菌家族一型和二型感染的疫苗。
[0020] 上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物的制备方法，具体制备步 骤如下：
[0021] (1)准备上述组方中各抗原原液和铝佐剂，按照PspA-mRXl、PspA-EF5668、 PspA-EF3296、PlyL460D四种蛋白最终浓度为10-100μ g/ml，铝离子最终浓度为0. 48mg/ ml，计算原液、佐剂以及补充的生理盐水用量；
[0022] (2)向计算所得量的生理盐水中加入对应量的铝佐剂混勻，按顺序依次加入 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四种原液，缓慢上下颠倒混匀，放入 2-8°C冷库过夜，即得。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] 上述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，可以预防覆盖95%以上 血清型的肺炎链球菌（家族一型和二型）的感染和侵袭，PspA-mRXl抗原组分中氨基酸肽 段的加入可以增强该组分在免疫原性组合物中所发挥的免疫功效，在肺炎预防方面具有广 泛应用，其制备方法简单，生产成本较低，生产周期缩短，适合规模化工业生产的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为PspA-EF5668抗原蛋白的分离纯化SDS-PAGE电泳图谱，其中，
[0026] 1 :破碎液；2 :SP流穿；3 :SP洗脱；4 :SP洗脱拖尾；5 :柱清洗；6 :SP洗脱；7 :Q流 芽；8 :杂蛋白清洗；9 :目标蛋白洗脱。
[0027] 图2为PlyL460D抗原蛋白的分离纯化SDS-PAGE电泳图谱，其中，
[0028] 1 :破碎液；2 :硫酸铵沉淀；3 :SP流穿；4 :洗脱；M =Marker ;5 :柱清洗。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0030] 实施例1
[0031] 单个抗原组分的制备
[0032] I、构建PspA-mRXl，按照申请号为201110455047. 3进行制备，具体方法包括：
[0033] 构建PspA-mRXl，利用大肠杆菌BL21 (DE3)表达PspA-mRXl，具体方法包括：将 mRX 1的PspA的DNA序列导入PET9a质粒，再将构建好的质粒导入到大肠杆菌E. Co I i BL21(DE3)中，得到含有PspA-mRXl的表达载体；
[0034] 取PspA-mRXl大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取IOOyL涂 布平板，37°C培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到IOOml摇瓶培养基中，37°C， 200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37°C，pH7. 0,转速200-600rpm，补料 采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为ImM的IPTG，培养结束后发酵液离心 取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清；
[0035] 对PspA-mRXl抗原蛋白进行分离纯化：将收获的菌体进行匀浆破碎，然后按照IL 破碎液加入30-250ml柠檬酸（IM)的比例加入柠檬酸，搅拌均匀后离心收集上清。将上清 经过SP FF进行纯化。首先使用pH为3-4的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬 酸进行洗脱，得到洗脱溶液。将洗脱液经过Q FF进行纯化。首先使用pH为7-8的柠檬酸 进行平衡，然后使用PH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到纯度大于95%的样品（PspA-mRXl)。 测定结果见图1。所得PspA-mRXl的序列为序列表〈400>1所述序列。
[0036] II、构建PspA-EF5668,利用大肠杆菌BL21 (DE3)表达PspA-EF5668,具体方法包 括：将EF5668的PspA的DNA序列导入PET9a质粒，再将构建好的质粒导入到大肠杆菌 E. Coli BL21 (DE3)中，得到含有PspA-EF5668的表达载体：
[0037] 取PspA-EF5668大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取100 μ L涂 布平板，37°C培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到IOOml摇瓶培养基中，37°C， 200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37°C，pH7. 0,转速200-600rpm，补料 采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为ImM的IPTG，培养结束后发酵液离心 取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清。
[0038] 对PspA_EF5668抗原蛋白进行分离纯化：将收获的菌体进行匀浆破碎，然后按照 IL破碎液加入30-250ml柠檬酸（IM)的比例加入柠檬酸，搅拌均匀后离心收集上清。将上 清经过SP FF进行纯化。首先使用pH为3-4的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬 酸进行洗脱，得到洗脱溶液。将洗脱液经过Q FF进行纯化。首先使用pH为7-8的柠檬酸进 行平衡，然后使用PH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到纯度大于95%的样品（PspA-EF5668)。 测定结果见图1。所得PspA-EF5668的序列为序列表〈400>2所述序列。
[0039] III、构建PspA-EF3296,利用同样的方法构建含有PspA-EF3296的大肠杆菌表达载 体，具体方法包括：
[0040] 取PspA-EF3296大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取100 μ L涂 布平板，37°C培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到IOOml摇瓶培养基中，37°C， 200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37°C，pH7. 0,转速200-600rpm，补料 采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为ImM的IPTG，培养结束后发酵液离心 取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清。
[0041] 对PSPA-EF3296抗原蛋白进行分离纯化：将收获的菌体进行匀浆破碎，然后按照 IL破碎液加入30-250ml柠檬酸（IM)的比例加入柠檬酸，搅拌均匀后离心收集上清。将上 清经过SP FF进行纯化。首先使用pH为3-4的柠檬酸进行平衡，然后使用pH为5-6的柠檬 酸进行洗脱，得到洗脱溶液。将洗脱液经过Q FF进行纯化。首先使用pH为7-8的柠檬酸进 行平衡，然后使用PH为5-6的柠檬酸进行洗脱，得到纯度大于95%的样品（PspA-EF3296)。 所得PspA-EF3296的序列为序列表〈400>3所述序列。
[0042] IV、构建PlyL460D的序列，利用大肠杆菌BL21 (DE3)表达ply460D，具体方法包 括：
[0043] 取ply460D大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株的冻存菌种一支，吸取100μL涂布 平板，37 °C培养箱过夜培养，使用涂布棒刮取菌苔转接到IOOml摇瓶培养基中，37 °C， 200-300rpm摇床培养3-4h，转接50L发酵罐，发酵温度37°C，pH7. 0,转速200-600rpm，补料 采用pH-star工艺流加，对数中期一次性加入终浓度为ImM的IPTG，培养结束后发酵液离心 取菌体，进行匀浆破碎，离心后收集上清。
[0044] 对ply460D抗原蛋白进行分离纯化：将菌体进行匀浆破碎，然后通过0. 2 μ m膜包 进行超滤回收，再经过30KD膜包浓缩换液。将溶液经过Q 650M进行纯化。首先使用pH为 8-9的tris进行平衡，然后使用含有50-250mM NaCl的tris(pH = 8-9)进行洗脱。将洗脱 液经过phenyl进行纯化。首先使用含有0. 5-3M NaCl的tris (pH = 8-9)进行平衡，然后 使用PH为8-9的tris进行洗脱。将洗脱液经过CHT I进行纯化。首先使用pH为6. 2的 PB(4-10mM)进行平衡，然后使用含有0. 5-1M NaCl的PB(4-10mM，pH = 7-8)进行洗脱，得 到样品（PlyL460D)。测定结果见图2。所得PlyL460D的序列为序列表〈400>4所述序列。
[0045] 实施例2
[0046] 免疫原性组合物的制剂配制
[0047] 免疫原性组合物的配制，按下表1进行：
[0048] 表 1
[0049]
【权利要求】
1. 一种用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，其特征在于：包括 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296 和 PlyL460D，其中，所述 PspA-mRXl、PspA-EF5668、 PspA-EF3296、PlyL460D 的含量均为 10-100 ii g/ml。
2. 根据权利要求I所述的用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，其特征 在于：所述 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296、PlyL460D 的质量比为 1:1:1:1。
3. 根据权利要求1所述的用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，其特征 在于：所述PspA-mRXl是根据申请号为201110455047. 3的发明专利制备得到的。
4. 根据权利要求1所述的用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物，其特征 在于：可应用于预防肺炎链球菌家族一型和二型感染的疫苗。
5. 权利要求1所述用于预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物的制备方法，其 特征在于：具体制备步骤如下： (1) 准备上述组方中各抗原原液和铝佐剂，按照PspA-mRXl、PspA-EF5668、 PspA-EF3296、PlyL460D四种蛋白最终浓度为10-100 ii g/ml，铝离子最终浓度为0? 48mg/ ml，计算原液、佐剂以及补充的生理盐水用量； (2) 向计算所得量的生理盐水中加入对应量的铝佐剂混匀，按顺序依次加入 PspA-mRXl、PspA-EF5668、PspA-EF3296和PlyL460D四种原液，缓慢上下颠倒混匀，放入 2-8°C冷库过夜，即得。
【文档编号】A61K39/116GK104306965SQ201410605626
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】朱涛, 段磊, 杨鸣鸣, 邵忠琦, 宇学峰, 毛慧华, 邱东旭 申请人:天津康希诺生物技术有限公司