与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记aad及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子育种领域，具体涉及与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失 分子标记AAD及其应用。
【背景技术】
[0002] 番茄是中国乃至世界上最重要的蔬菜之一。番茄的杂种优势表现比较明显，目前 种植的品种多为杂交种。然而，目前番茄杂交种制种多采用人工去雄、授粉，比较费时、费 工，制种成本高;而且可能因为去雄不及时或不彻底，影响杂交种纯度。另外，杂交种纯度检 测不论是采用传统的表型鉴定方法，还是采用分子标记检测方法，都比较费时、费钱。
[0003] 番前花青素缺乏突变体(anthocyanin absent，aa)植株各个部位表面由于缺乏花 青素而呈现为绿色，而正常番茄植株表面由于积累花青素而呈现不同程度的紫色。番茄花 青素缺乏突变体是一个核基因隐性突变体，在种子发芽露出子叶后就可以观察表型。因此， 利用含aa突变位点的番茄亲本作为母本配制杂交种，在杂交种幼苗阶段统计不同颜色(绿 色或紫色）的幼苗数量，就可以检测杂交种纯度。检测成本低，效率高。
[0004] 番前花青素缺乏突变位点aa还与雄性不育突变位点ms_10(male sterile 10)紧 密连锁。含有ms-10的番茄材料几乎100%不育，柱头外露，可以不需要人工去雄而直接授 粉，大大降低了制种人工成本。然而，ms-10是一个核基因隐性突变位点。制种时，作为母本 的不育株需要通过杂合单株自交或者杂合单株与不育株测交来获得。后代中，理论上只有 25%或50%的植株为不育株。当作为杂交制种母本的番茄材料同时含有aa和ms-10时，利用 上述方法繁殖不育株，在后代中选择绿色小苗(含aa)定植，可保证90%的植株为不育株。因 此，通常ms-10与aa同时应用于杂种优势育种。
[0005] aa是一个隐性突变位点，当该位点处于杂合状态时，其植株颜色与正常植株(野生 型)相同，无法区别于正常纯合植株。因此，将aa导入到优良番茄亲本中、或者选育含有aa的 优良番茄育种材料，如果采用传统的通过表型选育的方法，周期长、效率低。分子标记辅助 选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，可以缩短育种周期、提高育种效率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记。
[0007] 本发明的再一目的是提供上述与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子 标记的应用。
[0008] 根据本法的番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记，其物理位置为番 茄2号染色体上第45339693碱基到第45343097碱基（SL2.50版本），该片段缺失导致的表型 为番茄花青素缺乏。
[0009] 根据本发明的【具体实施方式】，首先通过精细定位将番茄花青素缺乏突变位点(aa) 定位到96.3kb范围内。在这96.3kb范围内，发现番茄花青素缺乏突变体中存在一个3.4kb的 缺失。该缺失片段编码一个参与花青素运输的谷胱甘肽转移酶（611^81:11；[01163-transferase，GST)0
[0010]本发明还提供了一套可以检测番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标 记的AAD特异性引物。正向引物(AAD-F)为5-GGGACAAAATACAACGACGAC-3，反向引物1 (AAD-R1)为 5-GCTGATGTTGATGTGAAGGAA-3，反向引物2(AAD-R2)为5-TAAAAGGGCTAGTGACTTGGTGT-3〇
[0011]根据本发明的【具体实施方式】，还提供一种鉴定番茄花青素缺乏性状的方法，包括 以下步骤：
[0012 ] 1)提取待测番茄的基因组DNA。采用常规的CTAB法提取基因组DNA。
[0013] 2)PCR扩增。以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用用于检测InDel标记AAD的3条 特异性引物进行PCR扩增。① PCR体系（20μ1): 50-100ngAU DNA模板ΙμL，10 X PCR反应缓冲 液2μ1，2·5πιΜ dNTPs 0·8μ1，10μΜ引物（3条）各0·3μ1，2·5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0·2μ1，(ΜΗ2〇 15. ΙμL。②PCR扩增程序为:94°C预变性4min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35 个循环;72°C延伸5min。
[0014] 3)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶浓度为1.5%。含有番茄花青素 缺乏(aa)纯合突变位点的植株可以检测到一条363bp的条带;aa位点为正常纯合(野生型） 的植株可以检测到一条487bp的条带;aa位点为杂合状态的植株可以同时检测到上述2条条 带。
[0015] 本发明可以替代传统的通过选择绿色植株以确保番茄育种材料含有花青素缺乏 (aa)突变位点的方法。通过分子标记辅助选择表型正常育种材料中的aa位点杂合植株，可 以缩短育种周期、提高育种效率。
【附图说明】
[0016] 图1为番茄花青素缺乏基因 AA的精细定位。a基因 AA的初步定位;b基因 AA的精细定 位;c基因 AA定位区域中基因编码情况。
[0017]图2为番前花青素缺乏(aa)突变体中的DNA片段缺失(deletion)示意图。
[0018] 图3为分子标记AAD检测aa突变体，野生型及其杂交后代的琼脂糖凝胶电泳图。Μ为 100bp DNAmarker，1为aa突变体，2，为野生型，3为Fi，4-15为F2植株。
[0019] 图4为分子标记AAD检测aa突变体和表型正常番茄育种材料的琼脂糖凝胶电泳图。 Μ为100bp DNA marker，LA3132为aa突变体，从152-1192到Yellow Pear为表型正常的樱桃 番前（Solanum lycopersicum var cerasiforme)，从Ailsa Craig|?IJZhongshu 正常的普通栽培番前（S. lycopersicum) 〇
【具体实施方式】
[0020] 下面通过【具体实施方式】来进一步阐明说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 若未特别指出，实施方式均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0021] 实施例1番茄花青素缺乏基因位点InDel AAD的确定
[0022] 以含有花青素缺乏突变位点aa的番茄材料为母本，植株表面呈紫色的醋栗番茄材 料为父本