一种玉米圆斑病病原物的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及一种特异性引物的快速检测病原物的方法， 具体涉及一种玉米圆斑病特异性引物快速检测病原物的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米生平脐懦抱[Bipolari s zei co la (G · L · Stout) Shoemaker，有性态为 Cochliobolus carbonumR.R.Nelson]，又称玉米圆斑病菌。该菌菌落黑褐色，轮纹状展开， 表面及边缘颜色稍浅，气生菌丝短，产孢量大;分生孢子梗中度黄褐色，顶端色浅，屈膝状弯 曲，单生或簇生，有时分支，宽3.0-5. Ομπι;分生孢子暗褐色，顶端和基细胞颜色相对浅，窄椭 圆形或近圆柱形，直或微弯，中部略宽，两端稍窄，基细胞钝圆，光滑，6-11个（多9个)假隔 膜，65.5-97.5X12.0-15.5μπι，平均:82.2X 13.3μπι;脐部略突出，明显，基部平截。
[0003] 该病原菌能够引起玉米圆斑病，是广泛发生于玉米产区的一种较为严重的叶部病 害。主要危害玉米叶部和果穗，侵染引起叶斑病(Northern corn leaf spot)和穗腐（ear rot)。1926年在美国伊利诺伊州首次发现其引起茎腐病(stalk rot)，1938年在美国印第安 纳州种植的自交系"Pr"上造成严重影响，随后在塞尔维亚等30多个国家相继发生;在中国， 1974年玉米圆斑病首次在吉林省农安县发现，由于大面积种植感病玉米品种，玉米圆斑病 在吉林省曾多次大面积暴发成灾，成为当时限制玉米生产的主要病害之一。20世纪90年代 陆续在我国台湾、浙江、陕西、河北、黑龙江、辽宁和内蒙古等省、自治区发现该病。但由于大 面积种植玉米圆斑病的抗病品种，此病发生并不严重，常年发病率只有10%~20%。近些年 来，由于环境气候的改变，该病在四川省、陕西省、云南省、重庆市、河北等地发生，并有加重 趋势。因此，尽早快速的检测该病原菌对减轻该病害造成的损失具有重要的意义。平脐蠕孢 类病菌的分类和鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等。传统的病菌鉴别方法耗时长、灵 敏度低以及经验性强，发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间，难以做到对病害发生 的及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。随着分子生物学的发展，不同分子技术 用于植物蠕孢类病害的检测。通过比对所测序的玉米生平脐蠕孢菌与GenBank中平脐蠕孢 属中其它几个种的EF-la基因的部分序列，利用DNAMAN设计出了可用于检测玉米生平脐蠕 孢菌的特异性引物，为从玉米叶片中快速、准确监测玉米生平脐蠕孢菌潜伏侵染与否奠定 了基础，有利于及早有效的采取防治措施。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是：玉米圆斑病菌能够引起玉米圆斑病，是广泛发生于 玉米产区的一种较为严重的叶部病害，近些年来，由于环境气候的改变，该病在四川省、陕 西省、云南省、重庆市、河北等地发生，并有加重趋势。因此，尽早快速的检测该病原菌对减 轻该病害造成的损失具有重要的意义，本发明提供一种快速检测玉米圆斑病的特异性引物 及使用方法。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] 一种玉米圆斑病病原物的快速检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0007] (1)真菌菌丝的收集；
[0008] (2)真菌DNA的提取；
[0009] (3)PCR扩增:PCR反应体系为，正向引物Y-EF和反向引物Y-ER各lyL，DNA模板lyL， Taq PCR Master Mix 12.5yL，ddH20补至25yL;PCR反应程序为94°C预变性3min;94°C变性 30s、55°C 退火 30s、72°C 延伸 30s，共 32 个循环；72°C 延伸 lOmin，4°C 保存。
[0010]所述正向引物γ-EF序列如SEQIDN0:l所示，反向引物Y-ER序列如SEQIDN0 :2所 不。
[0011] 所述正向引物和反向引物的浓度为5ym〇lAiL，DNA模板浓度为25ng/yL，Taq PCR Master Mix购自上海莱楓生物科技有限公司，所述Taq PCR Master Mix含有0·1μ/μL Taq DNA polymerase，0.4mM each dNTP，2XTaq Buffer，PCR增强剂和蛋白质稳定剂。
[0012] 一种玉米圆斑病病原物的快速检测方法作为玉米叶片中圆斑病病原菌监测的应 用。
[0013] 本发明的有益效果是:为从玉米叶片中快速、准确监测玉米平脐蠕孢菌潜伏侵染 与否奠定基础，有利于及早有效的采取防治措施。
【附图说明】
[0014] 图1玉米圆斑病单重PCR引物特异性检测图，1: (ZM10587-2)，2 : (ZM10094-2)，3 : (ZM10233-3),4：(09316-5),5：(ZM09313-2-1),6：(ZM10321),7：(ZM10599),8：(ZMLC025-2)，9:(ZM10322-3)，10:(ZM09358)，11:(ZTY030032)，12:(ZM10239-1)，13:(ZM09362-2)， 14:(DH020637)，15:(ZM10601)，16:(ZM10602)，17:(ZM10603)，18:(ZM10604)，19: (ZM10605)，CK:空白对照，M: DL2000Marker;
[0015]图2玉米圆斑病引物灵敏度的检测图，Μ为分子标量DL1000，CK为阴性对照；泳道1-12 分别是在 25yL 的体系中含有 10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg、100ag、10ag、 lag、0. lag DNA量的扩增结果；
[0016] 图3玉米发病叶片的检测，Μ为分子标量DL2000的Marker ;CK为阴性对照；泳道1为 健康的玉米叶片提取DNA扩增结果;泳道2为发病玉米叶片提取DNA扩增结果;泳道3为阳性 对照。
【具体实施方式】
[0017] 一种玉米圆斑病病原物的快速检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0018] (1)真菌菌丝的收集；
[0019] (2)真菌DNA的提取；
[0020] (3)PCR 扩增。
[0021] 所述正向引物Y-EF序列如SEQIDNO:l所示，反向引物Y-ER序列如SEQIDNO:2所 不。
[0022] 一种玉米圆斑病病原物的快速检测方法作为玉米叶片中圆斑病病原菌监测的应 用，具体步骤如下：
[0023] 一、真菌菌丝的收集
[0024]取保存的菌株(见附表一)接种于PDA平板上，25°C下生长3天，挑新鲜菌丝，接种于 装有1/3体积PDB的250mL三角瓶中。25°C120r/min，培养3-4天，至生成大量菌丝团为止。双 层纱布过滤，蒸馏水连续冲洗，滤纸吸干水分，置于1.5mL离心管-20°C保存备用。
[0025]表一供试菌株的来源及编号
[0028] 二、真菌DNA的提取
[0029]采用改进的CTAB法提取真菌菌丝DNA，具体步骤如下：
[0030] (1)取适量的菌丝（约0.5g)于研钵中，加液氮快速磨成粉末（至少加液氮研磨3 次)；
[0031] (2)将样品粉末用灭菌的药匙转移到1.5mL的离心管中，加700yL在65°C水浴锅中 预热的CTAB提取缓冲液，然后将离心管放在65°C的恒温水浴中保持45min，每隔lOmin轻轻 的颠倒几次，使粉末和缓冲液混合均匀；
[0032] (3)12000印111，4。(3离心1〇111；[11，吸取上清液；
[0033] (4)加入700yL抽提液I (苯酚:氯仿：异戊醇=25 :24:1)，轻轻颠倒数次至溶液混 匀；
[0034] (5)12000印111，4。(3离心10111丨11，吸取上清液；
[0035] (6)加入700yL抽提液I，轻轻颠倒数次至溶液混匀；
[0036] (7)12000印111，4。(3离心10111丨11，吸取上清液；
[0037] (8)加入600yL抽提液Π (氯仿:异戊醇= 24:1)，反复混匀；
[0038] (9)12000印111，4。(3离心10111丨11，吸取上清液；
[0039] (10)加入600yL预冷的异丙醇，轻轻摇匀，放在冰上30min;
[0040] (11)弃上清，并加入600yL 70%的乙醇洗涤沉淀两次；
[0041] (12)置于无菌操作台上，吹干(约20min);
[0042] (13)加入20-200yLddH20，溶解 DNA;
[0043] (14)使用分光光度计检测DNA浓度，并将浓度调整为约100ngAiL，-20°C保存备用。
[0044] 三、PCR 扩增
[0045] (1)单重PCR反应体系：Taq PCR Master Mix(含0 · Ιμ/yL Taq DNA polymerase， 0.4mM each dNTP，2XTaq 81^€61，？0?增强剂和蛋白质稳定剂）12.541^，正向引物（54111〇1) 和反向引物各（5ymol) lyL，DNA 模板（25ng/yL) lyL，ddH20 补至 25yL。
[0046] (2 )PCR 反应条件：94°C 预变性 3min; 94°C 变性 30s、55°C 退火 30s、72°C 延伸 30s，共 32个循环;72°C延伸lOmin;扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测及UVI凝胶成像系统分析 结果(见图1)。由图1可知只有玉米圆斑病的病原物跑出了 137bp的条带，其它菌株均未跑出 条带。
[0047]四、引物灵敏度检测
[0048] 将原有玉米圆斑病的基因组DNA从10ng/yL开始稀释10倍得到12个处理（1、10一 \ 10' 10-4、ΚΓ5、10' 1〇Λ 10-8、10-9、10-1())，采用优化好的扩增体系及程序，分别扩增，检测， 结果如图2所示。由图2可知，10ng-lng(稀释10倍)均能扩增出清晰的PCR条带(泳道1、2)，而 稀释100倍、1000倍、10000倍后扩增的条带也隐约可见(泳道3、4、5);说明此方法对玉米圆 斑病检测的灵敏度非常高，约为lpg/yL，可见该方法可靠。
[0049] 五、发病植株组织中病菌的快速检测
[0050] 为了验证能否从玉米病组织中检测到玉米圆斑病的病原菌，用玉米生平脐蠕孢接 种健康的玉米叶片，模拟玉米圆斑病病原菌的自然侵染，接种发病后进行病原菌检测。以接 种发病的玉米叶片组织总DNA为模板，利用引物Y-EF/Y-ER进行PCR扩增，同样可以扩增出 137bp的特异性片段，而健康玉米叶片组织DNA未能扩增出特异性条带（图3)。
【主权项】
1. 一种玉米圆斑病病原物的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤： (1) 真菌菌丝的收集； (2) 真菌DNA的提取； (3 )PCR扩增：PCR反应体系为，正向引物Y-EF和反向引物Y-ER各lyL，DNA模板lyL，Taq PCR Master Mix 12.5yL，ddH20补至25yL;PCR反应程序为94°C预变性3min;94°C变性30s、 55°C退火30s、72°C延伸30s，共32个循环;72°C延伸lOmin，4°C保存。2. 如权利要求1所述的玉米圆斑病病原物的快速检测方法，其特征在于，所述正向引物 Y-EF序列如SEQIDNO:l所示，反向引物Y-ER序列如SEQIDNO:2所示。3. 如权利要求1所述的玉米圆斑病病原物的快速检测方法，其特征在于，所述正向引物 和反向引物的浓度为5ymol/yL，DNA模板浓度为25ng/yL。4. 一种玉米圆斑病病原物的快速检测方法作为玉米叶片中圆斑病病原菌监测的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，涉及一种特异性引物的快速检测病原物的方法，具体涉及一种玉米圆斑病特异性引物快速检测病原物的方法，所述检测方法包括以下步骤：（1）真菌菌丝的收集；（2）真菌DNA的提取；（3）PCR扩增：PCR反应体系为，正向引物Y-EF和反向引物Y-ER各1μL，DNA模板1μL，Taq？PCR？Master？Mix？12.5μL，ddH2O补至25μL；PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。为从玉米叶片中快速、准确监测玉米平脐蠕孢菌潜伏侵染与否奠定基础，有利于及早采取有效的防治措施。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105525011
【申请号】CN201610059447
【发明人】张猛, 马庆周, 耿月华, 武海燕, 孙斌
【申请人】河南农业大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月28日