耐灰叶斑病玉米及其生产方法

专利名称：耐灰叶斑病玉米及其生产方法
技术领域：
本发明涉及耐灰叶斑病(GLS)玉米植物以及生产该种植物的方法。更具体地讲， 本发明涉及能够引起玉米GLS耐受性的可确认的遗传物质，以及该遗传物质基因渗入到玉 米植株中的现象。此外，本发明涉及来自一个或多个亲本植物的期望遗传物质以一定的速 度、精密度、和准确度渗入到子代植物中的现象。
背景技术：
从历史上看，玉米是一种具有食物、饲料和工业用途的重要作物。影响玉米的任何 环境胁迫因素如病害可对这些用途的玉米谷物可用性产生影响。灰叶斑病(下文称为GLS)在过去的三十年中已经变成一种突出病害，并且在美国 和其他主要玉米产地如墨西哥、巴西、欧洲、和南非是一种显著的叶片病害。GLS的发病率和 严重性在美国似乎是渐增的(Wang等人，Phytopathology 88 1269-75 (1998))，这或许是 由于玉米种植增加而耕作减少的原因。这些病症可能导致真菌越冬以及下一季节的早期感 染(Laterall 和 Rossi，Plant Dis. 67 :842_37 (1983))。在美国在 GLS 流行期间已经报道 了超过 50% 的产量损失(Laterall 和 Rossi，同上；Lipps, Plant Dis. 71 :281 (1987))，并 且其中严重流行导致茎倒伏和早衰增加时预计的损失已经高达100% (Laterall和Rossi， 同上)。引起GLS的真菌病原体玉米灰叶斑病菌(Cercospora zeae-maydis)表征性地 生成与叶脉平行的、长矩形浅灰-棕褐色叶片损伤(Tehon和Daniels，Mycologia 17 240-49(1925) ；Latterell 和 Rossi，同上；Ward 等人，Plant Dis. 83 :884_95 (1999))。损伤 可使部分或全部叶片枯萎并且通常首先出现在较低的叶片中。GLS引起的枯萎与光合作用 区域的早熟损失关联。开花后玉米植株的主要接收区是穗，枯萎诱导植物将光合作用产物 以高水平从茎和根转移到穗，因此引起早衰和产量降低。具有GLS耐受性的玉米品种的快速有效的开发是有益的。在商业杂交体和自交体 中的GLS耐受性水平随品种而不同。已经报道了一些表现出强耐受性的品种。然而，使用 表型选择以将GLS性状从耐受性品种渗入到易感品种中可能是耗时的并且是困难的。GLS 对环境条件敏感并且需要高湿度和叶片长期湿润。这种敏感性使得每年仅基于表型来可靠 地选择 GLS 耐受性变得困难(Lehmensiek 等人，Theor. Appl. Genet. 103 :797_803 (2001))。 特定的病害筛选位点可能操纵起来比较昂贵，并且为了区分耐受性水平，植物必须生长至 成熟。与之相反，通过使用与GLS耐受性关联的分子标记进行选择具有以下优点使得至少 一些选择仅基于子代的遗传组合物进行。因此，可在植物生命周期非常早的阶段测量GLS 耐受性，甚至在种子阶段。通过使用与GLS耐受性性状关联的分子标记提高选择速率意味 着具有GLS耐受性的植物育种能够以较快速率发生，并且能够较迅速地开发商业上可接受的耐GLS植物。发明概述本发明的实施方案基于与提高GLS耐受性显著相关的基因座的精细作图，以及将 该知识应用于植物育种。提供了鉴定耐GLS玉米植物的组合物和方法。提供了利用标记进 行育种以制备耐GLS的玉米植物的方法，以及通过此类方法产生的植物。
实施方案包括使用改良的供体品种PHJEP作为种质来源以将GLS耐受性渗入到玉 米植物及其子代中。所述品种的代表性样品已经作为保藏号PTA-8851被保藏在美国典型 培养物保藏中心(ATCC)。一个方面是命名PHJEP的玉米品种的种子，其中所述玉米品种的代表性样品已经 以保藏号PTA-8851被保藏，或者得自该种子的子代种子，所述种子包含PHJEP灰叶斑病耐 受性基因座，并且当生长时，产生表现出耐灰叶斑病的植物。由PHJEP种子或其子代的种子 产生的植物也是受关注的，这些植物的细胞也同样受关注。实施方案也包括得自PHJEP的特定重组染色体区间，它们与GLS耐受性提高关联， 并且将该染色体区间基因渗入到其他品种和植物中。一些实施方案包括将PHJEP的特定单 倍型基因渗入到其他品种和植物中。在一个方面，子代种子中的PHJEP灰叶斑病耐受性基因座位于PHJEP来源的染色 体区间上，该区间包含由UMC1346和UMC1702限定的PHJEP的染色体区域。在另一方面， 子代种子中的PHJEP灰叶斑病耐受性基因座由单倍型限定，它包含在PHM 00045-01上 的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上的等位基因G、在PHM 01811-32上的等位基因T、在PHM 01963-15上的等位基 因T、在PHM 01963-22上的等位基因C、在PHM 05013-12上的等位基因T、在PHM 00586-10 上的等位基因T、在PHM 00049-01上的等位基因A。在另一个方面，PHJEP灰叶斑病耐受性 基因座由单倍型限定，它包含在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等 位基因A、在PHM 01963-22上的等位基因C、和在PHM 05013-12上的等位基因T。在其他方面，子代种子是PHJEP灰叶斑病耐受性基因座的回交转化体。由选自 PHVNV, PHW3Y、PHVRA, PHEWB、和PHWRC的轮回亲本产生的回交转化体的子代种子也是受关 注的。在其他方面，子代种子是杂交品种，并且杂交品种的至少一个自交亲本是PHJEP 灰叶斑病耐受性基因座到选自PHVNV、PHW3Y、PHVRA, PHEWB、和PHWRC的轮回亲本的回交转 化体。其他实施方案包括鉴定包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座的第一玉米植物的 方法，所述方法包括(a)获取所述第一玉米植物在染色体4上BNLG1755和UMC1299之间 的染色体区间的第一遗传特征图，(b)从包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座的第二玉米 植物获取第二遗传特征图，其中所述基因座位于在染色体4上BNLG1755和UMC1299之间， 和(c)比较所述第一遗传特征图和所述第二遗传特征图。在另一方面，如果所述第一玉米植物包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座，该方 法还包括选择所述第一玉米植物的方法。此外，第二遗传特征图可为PHJEP或PHJEP子代的遗传特征图，或者可包含一个或 多个标记等位基因，所述等位基因选自在PHM00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上的等位基因G、在 PHM01811-32上的等位基因T、在PHM 01963-15上的等位基因T、在PHM01963-22上的等 位基因C、在PHM 05013-12上的等位基因T、在PHM00586-10上的等位基因T、以及在PHM 00049-01上的等位基因A。第二遗传特征图也可包含一个或多个标记等位基因，所述等位基因选自在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 01963-22上的等位基 因C、和在PHM 05013-12上的等位基因T。在其他方面，遗传特征图能够被确定为在染色体4上BNLG1755和UMC0371之间 的染色体区间。此外，与灰叶斑病耐受性关联的基因座可为PHM 15534、PHM 04694、PHM 0181UPHM 01963, PHM 05013、或 PHM 00586。通过所述方法鉴定的玉米植物和那些玉米植物的细胞及种子也是受关注的。另一个实施方案包括鉴定包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座的第一玉米植物 的方法，所述方法包括(a)获取所述第一玉米植物在染色体4上的染色体区间的第一遗传 特征图，所述区间由以下序列描述并且包括以下序列SEQ ID NO :86，或基于Clustal V比 对方法与SEQID NO :86具有95%同一性的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :87，或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 87具有95%同一性的核苷酸序列，(b)从包含与灰叶斑病耐受性 关联的基因座的第二玉米植物获取第二遗传特征图，其中所述基因座在所述区间中，以及 (c)比较所述第一遗传特征图和所述第二遗传特征图。其他实施方案包括包含以下单倍型的玉米种子在PHM 00045-01上的等位基因 G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上 的等位基因G、在PHM 01811-32上的等位基因T、在PHM 01963-15上的等位基因T、在PHM 01963-22上的等位基因C、在PHM 05013-12上的等位基因T、在PHM 00586-10上的等位基 因T、在PHM 00049-01上的等位基因A ；并且玉米种子包含以下单倍型在PHM 00045-01 上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 01963-22上的等位基因C、和在 PHM05013-12上的等位基因T。由该玉米种子生成的植物也是受关注的。^X在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制，它当然能够改变。 也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本说明 书和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。 因此，例如术语“一个植物”也包括多个植物；也取决于上下文，使用的术语“植物”也可包 括该植物遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”实际上任选地包括该核酸分子的多个 拷贝；同样地，术语“探针”任选地(并且通常)包括许多相似或相同的探针分子。除非另外说明，核酸是以5'到3'方向从左往右写。说明书中所述的数字范围包 括限定范围的端值并且包括在限定范围内的各个整数或任何非整数的分数。除非另外指 明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解相同的 含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的测 试实践，但本文描述了优选的材料和方法。在本发明的描述和权利要求中，将根据下文列陈 述的定义使用以下术语。“植物”可为整个植株、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可指代以下任何一种材料整个植株、植物部分或器官(例如叶片、茎、根等)、植 物组织、种子、植物细胞、和/或子代的相同材料。植物细胞是从植物中获取的细胞或来源 于从植物中所获取细胞经培养出的细胞。术语“玉米植物”包括整个玉米植株、玉米植物细胞、玉米植物原生质体、能从其中 再生玉米植株的玉米植物细胞或玉米组织培养物、玉米植物愈伤组织、玉米植物丛生物和 玉米植物中的完整玉米植物细胞或玉米植物部分，如玉米种子、玉米芯、玉米花、玉米子叶、 玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根 、玉米根尖等。术语“玉米”包括玉米(Zea mays)物种的任何成员。“玉米(maize)”和“玉米 (corn)”本文可互换使用。“种子”是包封在保护种皮中的小胚体。它是成熟的植物胚珠在授精后生成的产 物。“种质”指个体(例如一个植株)、一组个体(例如一个植物品系、品种或家族)、或 来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物 或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构 成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种 质包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或者植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它 们能够被培养成整个植株。当与植物一起使用时，“品种”包括植物学和栽植植物，包括自交体和杂交体，并且 指植物学分类上已知的最低阶层的植物族群，其中该族群可由给定基因型或基因型组合的 特性的表达来限定。术语“自交体”指基本上纯合的品种。术语“杂交体”指两个遗传上不同的个体之间自交产生的任何子代，包括两个不同 自交系之间的杂交。术语“等位基因”指在特定基因座处发生的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。当等位基因与性状关联时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发 生在包含等位基因的植物中的指示时，等位基因与性状“关联”。“BAC”或细菌人工染色体是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)天然存在的F因 子的克隆载体。BAC能够接受DNA序列的较大插入序列。在玉米中，已经将许多BAC或细菌 人工染色体装配成重叠群(重叠的邻接基因片段，或“邻接DNA”)，它们每个包含玉米基因 组DNA的较大插入序列。“有利等位基因”是在特定基因座的等位基因，该基因座赋予或有助于产生农学上 期望的表型，例如GLS耐受性，或者作为另外一种选择是允许鉴定能够从育种程序或种植 中除去的易感植物的等位基因。标记的有利等位基因是分离有利表型的标记等位基因，或 者作为另外一种选择，分离易感植物表型并因此提供鉴定易感病植物的有益效果。染色体 片段的一种有利等位基因形式是包括在位于染色体片段上的一个或多个基因座上的核苷 酸序列的染色体片段，所述核苷酸序列有助于产生优异的农学性能。“等位基因频率”指等位基因存在于个体、品系、或一组品系中的基因座上的频率 (比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体
8分别具有1. 0,0. 5、或0. 0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样品的等 位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。同样地，人们能够通过平均化构成种群的品 系的等位基因频率来计算该种群品系中的等位基因频率。就一组限定数目的个体或品系而 言，可将所有等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其他指定组)的计 数。当等位基因与性状关联时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发 生在包含等位基因的植物中的指示时，等位基因与性状“正”相关。当等位基因与性状关联 时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将不发生在包含等位基因的植物中的 指示时，等位基因与性状“负”相关。假如个体在等位基因仅有一种类型的等位基因(例如二倍体个体在两个同源染 色体中的每一个的基因座上具有一拷贝的相同等位基因)，则该个体是“纯合的”。假如一种以上的等位基因类型存在于给定基因座上(例如二倍体个体具有两个 不同等位基因中的每一个的一个拷贝)，则该个体是“杂合的”。杂合情况的一种特殊情况是其中一个染色体具有一个基因的等位基因而其他染 色体完全缺乏该基因、基因座、或区域一换句话说，具有相对于第一染色体的缺失。这种情 况称为“半合子的”。术语“同质”指一组成员在一个或多个特定基因座上具有相同基因型。与之相反， 术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座上基因型不同。“基因座”是多态核酸、性状决定子、基因、或标记所在的染色体区域。因此，例如 “基因座”是物种基因组中的特定染色体位置，其中能够发现特定基因。与GLS耐受性关联 的基因座指示与表型可计量的GLS耐受性直接相关的基因组上的区域。“遗传互补序列”具有至少一套或倍数性等位基因。例如，单交种杂合体继承两个 遗传互补序列，各来自每个自交亲本。术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种 种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。QTL 能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。术语“标记”、“分子标记”、“标记核酸”、和“标记座位”指核苷酸序列或其编码的产 物(例如蛋白)，当鉴定关联的基因座它们时用作参考点。标记能够来源于基因组核苷酸序 列或表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA或cDNA)，或来源于编码的多肽。该术语 也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物 对的核酸。很多玉米分子标记是本领域已知的，并且被公布于或得自多个来源，例如Maize GDB 因特网资源和 University ofArizona 运营的 Arizona Genomics Institute 因特网资 源。同样地，已经建立了用于检测分子标记的多种方法。“多态性，，是DNA中的变异，这种现象太过普遍以至于不仅仅是由于新的突变而产 生(即种群中的发生频率为至少)。在子代中分离的任何差异继承的多态性状(包括 核酸多态性)是潜在的标记。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复 元件、点突变、重组事件、或转座因子的存在和序列。“标记探针”是可用于鉴定标记座位存在与否的核酸序列或分子，例如与标记座位 序列互补的核酸分子探针。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记座位上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交 时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。“标记座位”是可用于追踪存在的第二连接基因座的基因座，例如编码或有助于表 达表型性状的连接基因座。例如标记座位能够用于监控等位基因在某一基因座的分离，如 QTL,它们与标记座位在遗传上或在物理上连锁。“标记等位基因”或者“标记座位的等位基因”是种群中位于标记座位的多个多态 性核苷酸序列的其中一个，它就标记座位而言是多态的。在某些方面，本发明提供与玉米 GLS耐受性关联的标记座位。期望每个鉴定的标记与有助于产生GLS耐受性的遗传元件如 QTL在物理上和遗传上相近(导致物理和/或遗传连锁)。“遗传标记”是种群中的多态核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区 分出它们的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。该术语也指与基因组序列互 补的核酸序列，如用作探针的核酸。术语“遗传标记”可指任何类型的核酸基的标记，包括 但不限于限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP)、 简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、随机扩增多态性 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS) (Rafalski 和 Tingey，1993，Trends in Genetics 9 :275_280)、扩增片段
(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) (Vos ^A, 1995, Nucleic Acids Res. 23 :4407_4414)、单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP) (Brookes, 1999, Gene 234 :177-186)、序列特异性扩增区域(Sequence Characterized Amplified Region, SCAR)(Paran 禾口 Michelmore，1993， Theor. App1. Genet. 85 :985_993)、 序列标签位点(Sequence Tagged Site, STS) (Onozaki 等人，2004，Euphytical38 255-262)、单链构象多态性(Single Stranded ConformationPo 1 ymorphism, SSCP) (Orita 等人，1989，Proc Natl Acad Sci USA86 :2766_2770)、简单重复序列区间(Inter-Simple Sequence Repeat, I SSR) (Blair 等人，1999，Theor. App 1. Genet. 98 :780_792)、反转录转座 TitL ^ Γ±|^^ti (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism, IRAP) 转座子微卫星扩增多态性(Retrotransposon-MicrosatelliteAmplified Polymorphism, REMAP) (Kalendar 等人，1999，Theor. App 1. Genet. 98 :704_711)、RNA 裂解产物(如 Lynx 标 记)等。术语“插入缺失(indel) ”指插入或缺失，其中可将一个品系相对于第二品系称为 插入，或者可将第二品系相对于第一品系称为具有缺失。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行 检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测 (RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、 植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸 多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检 测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。 经由酶切扩增多态性序列(CAPS)对基因绘图的方法也是为人们熟知的(参见例如 Konieczny&Ausubel, Plant J. 4 :403_10(1993))。“标记辅助选择”(或MAS)是一种基于标记基因型进行表型选择的方法。
“标记辅助反选择”是一种通过它将标记基因型用于鉴定植物的方法，所述植物将 不被选择，使得它们被从育种程序或种植中去除。“参比序列”是用作序列比对基准的限定序列。参比序列通过对基因座上的多个品 系进行基因分型、以序列比对程序进行核苷酸序列比对(例如Sequencher)、然后获取比对 的共有序列来获取。“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体(或连锁群)上的基因座间的基因 连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。该基因座是遗传界标或标记，并且就每个基 因图谱而言，标记间的距离通过它们之间的重组频率来测量。基因图谱是作图的种群、使用 的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基 因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。例如，在内部来源的基因图谱上(本文 也将Pioneer Hi-Bred称为“PHB”)的IOcM大概等同于在IBM2 2005 neighbors框图谱 (在玉米⑶B上可用的高分辨率图谱)上的25-30cM。然而，使用常见标记的通用框能够将 一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定 在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的其他基因座。“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的 种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于 围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。基因组的“物理图谱”指绝对距离(例如在碱基对或分离和重叠邻接的基因片段 如重叠群中测量的距离)。基因组的物理图谱不考虑物理图谱上不同点之间的遗传行为 (例如重组频率)。“重组”是在减数分裂期间同源染色体片段的交换，以此重组连锁的基因；也指此 类交换的产物。“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或 减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。可将遗传重组频率用厘摩(cM)表示，其中一 cM是两个遗传标记间的距离，它们显示的重组频率(即那两个标记间每100次细胞分 裂发生交换事件一次)。“基因组”指总DNA或整套基因，由染色体或染色体组携带。如本文所用，术语“连锁”用于描述一个标记座位与另一个标记座位或一些其他基 因座(例如耐受性基因座)“关联”的程度。较接近的两个标记座位位于相同染色体上，越 是接近，它们将结合成配子，并且一起出现的频率将越高；非常接近的标记座位基本上不再 分离，因为它们之间将出现交换点的可能性非常小。如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机 分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。术语“连锁不平衡”指基因座或性状(或者两者都有)非随机地分离。在任一情 况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以大 于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离性状的情况下，产生该性状的基因座彼此 足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁不平衡最常见地用量度r2测量，它通过Hill，W.G.和Robertson，A, Theor. Appl. Genet. 38 =226-231(1968)的公式计算。当r2 = 1时，两个标记座位间存在完全的LD，意味着标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2值大于1/3指示足够强的 LD 将被用于作图(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3:299-309(2002))。因此，当 成对标记座位间的r2值大于或等于0. 33,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、或1. 0时，等位基因 处于连锁不平衡。如本文所用，分子标记和表型间的连锁关系被给定为“概率”或“调整概率”。概 率值是表型的特定组合和特定标记等位基因随机性存在或不存在的统计学可能性。因此， 概率评分越低，表型和特性标记将共分离的可能性越大。在某些方面，认为概率评分是“显 著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05 (ρ = 0.05，或 5%的概率)是共分离的显著性指示。然而，本发明不受该特定标准的限制，并且可接受的 概率可以是小于50% (ρ = 0. 5)的任何概率。例如，显著概率可小于0. 25、小于0. 20、小于 0. 15、或小于0. 1。术语“物理上连锁”有时用于指示两个基因座例如两个标记座位物理上存在于相 同染色体上。有利的是，两个连锁基因座位置接近，使得减数分裂期间这两个基因座不发生高 频率的同源染色体对间的重组，例如使得连锁基因座至少约90 %的时间，如91 %、92%、 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%,99. 75%、或更多的时间共分离。在本专利申请中，短语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或 小于约10% (即在基因图谱上的分离频率不超过IOcM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少 90%的情况下共分离。当标记座位显示与期望性状(例如病原体耐受性)共分离(连锁) 的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。例如在某些方面，这些标记可被称为连锁QTL标 记。在其他方面，尤其有用的分子标记是那些连锁或紧密连锁的标记。在某些方面，能够将连锁表示成任何期望的限制或范围。例如在一些实施方案中， 两个连锁基因座是被小于50cM的图谱单位分开的两个基因座。在其他实施方案中，连锁基 因座是被小于40cM的图谱单位分开的两个基因座。在其他实施方案中，两个连锁基因座是 被小于30cM的图谱单位分开的两个基因座。在其他实施方案中，两个连锁基因座是被小于 25cM的图谱单位分开的两个基因座。在其他实施方案中，两个连锁基因座是被小于20cM的 图谱单位分开的两个基因座。在其他实施方案中，两个连锁基因座是被小于15cM的图谱单 位分开的两个基因座。在某些方面，有利地是限定连锁的相等范围，例如介于10和20cM之 间，或者介于10和30cM之间，或者介于10和40cM之间。标记与第二基因座连锁越紧密，标记越可能变成第二基因座的指示。因此在一个 实施方案中，紧密连锁的基因座如标记座位和第二基因座显示10%或更低，优选约9%或 更低，更优选约8 %或更低，更优选约7 %或更低，更优选约6 %或更低，更优选约5 %或更 低，更优选约4%或更低，更优选约3%或更低，更优选约2%或更低的基因座内重组频率。 在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约或更低的重组频率，例如约0. 75%或更 低，更优选约0. 5%或更低，更优选约0. 25%或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且 它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10 % (例如约9 %、8 %、7 %、6 %、 5%,4%,3%,2%U%>0. 75%,0. 5%,0. 25%、或更低)的两个基因座也称为彼此紧密连 锁。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记 彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。
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当涉及两个遗传因子间的关系时，如有助于产生耐受性和紧密关联标记的遗传因 子，“相引”相连锁指示下述状态其中在耐受性基因座上的“有利”等位基因与相应连锁的 标记座位的“有利”等位基因物理上附连在相同染色体链上。在相引相中，两个有利等位基 因被继承了该染色体链的子代一起继承。在“相斥”相连锁中，在受关注基因座上的“有利” 等位基因与在连锁标记座位上的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因 不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。如本文所用，术语“染色体区间”、“染色体的区间”、“染色体片段”、或“染色体的片 段”命名基因组DNA的邻接线性片段，它驻留在植物中的单染色体上，通常定义关于限定染 色体区间的端点的两个标记。位于单染色体间隔上的遗传因子或基因是物理上连锁的。不 特别限定染色体区间的大小。在某些方面，例如在本发明的上下文中，位于单染色体区间中的遗传因子一般也 是遗传连锁的，通常在例如小于或等于20cM或者小于或等于IOcM的遗传重组距离内。艮口， 在单染色体区间内的两个遗传因子发生重组的频率小于或等于20%或10%。在一个方面，本发明的任何标记与等于或小于50cM的任何其他标记连锁(遗传上 和物理上)。在另一方面，本发明的任何标记与非常接近(例如距离等于或小于IOcM)的任 何其他标记紧密连锁(遗传上和物理上)。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可被彼 此定位于 9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 75,0. 5 或 0. 25cM 或更小。短语“灰叶斑病”或“GLS”指由真菌病原体玉米灰叶斑病菌引起的谷物病害，它表 征性地生成与叶脉平行的、长矩形浅灰_棕褐色叶片损伤。玉米植物对GLS “新赋予的耐受性”或“提高的耐受性”指示玉米植物当导入病害 如诱发剂玉米灰叶斑病菌时其产量和/或存活能力或其他相关农学指标较少受影响。耐受 性是一个相对定义，指示被感染的植物比另一株同样处理的、更易感的植物玉米产量更高。 即，与易感玉米植物相比，在耐受性玉米植物中病害引起的玉米存活率和/或产量减少的 程度较低。技术人员将会知道玉米植物对GLS的耐受性相差很大，能够提供一系列耐受性较 高至耐受性较低的表型，并且耐受性取决于感染的严重程度能够发生变化。然而，通过简单 的观察，技术人员能测定不同植物、植物品系或植物家族对GLS的相对耐受性或易感性，此 外也将认识到“耐受性”的表型等级。例如可使用1至9的视觉评分指示GLS耐受性。评 分越高指示耐受性越强。仅当在测量实验中存在足够的选择压力时，数据将被收集。在本发明上下文中的术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合 (例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交 (自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配 子融合行为。术语“渗入”指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的 现象。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂 交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为 另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在 融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期 望的等位基因可为例如标记的选择等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，能够将包含期
13望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并选择期望的等位基因以产生固 定在选择遗传背景中的等位基因。当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。“回交转化体”是通过回交将某一基因座或性状渗入某一品种的产物。“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中， “供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或 多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植物。例 如参见 Ragot, M.等人(1995)Marker-assisted backcrossing :a practical example, inTechniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72 卷第 45—56 页，以及 Openshaw 等人，(1994)Marker-assisted Selectionin Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data，H 41—43 M。率刀女台Fl ft 术语“BC1”指轮回亲本的第二次使用，“BC2”指轮回亲本的第三次使用等等。“品系”或“品种”是一组具有相同亲本的个体，它们一般是某种程度的自交体，并 且一般在大多数基因座是纯合的和同质的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”指子代的 自交体亚群，它们与相同祖先来源的其他相似自交体亚群遗传上不同。“祖先品系”是用作基因来源的亲本品系，例如用于开发优良品系。“祖先种群”是 已经产生大部分基因变异的一组祖先，这些基因变异被用于开发优良品系。“子代”是祖先 的子代，并且可通过多代育种从它们的祖先分离得到。例如优良品系是它们的祖先的子代。 “谱系结构”规定了子代和产生该子代的各个祖先的关系。谱系结构能够跨越一代或多代， 描述子代及其父母亲本、祖父母亲本、曾祖父母亲本等的关系。“优良品系”或“优良品种”是农学上优异的品系，该品系由多代育种以及选择优异 农学特性产生。多个优良品系对玉米育种领域的技术人员来说是可用的和已知的。“优良 种群”是一类优良个体或品系，根据给定作物物种如玉米的农学上优异的基因型，它们将可 用于代表技术发展水平。同样的，“优良种质”或优良品种的种质是农学上优异的种质，通常 来源于和/或能够生成具有优异农学性能的植物，如现有的或新开发的优良玉米品系。与之相反，“外来玉米品种”或“外来玉米种质”是来源于不属于可利用优良玉米品 系或品种的种质的玉米的品种或种质。在杂交发生在两个玉米植株或品种的种质之间的情 况下，外来种质的子代不与它杂交的优良种质密切相关。最常见的是外来种质不来源于任 何已知的玉米优良品系，而是选择将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序。在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录 形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法包括聚合酶链反应 (PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转 录)方法。“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录 等)通过扩增模板核酸制备的核酸。“基因组学核酸”是按顺序对应于细胞中的可遗传核酸的核酸。常见实例包括核基 因组DNA及其扩增子。在某些情况下基因组核酸不同于剪接RNA或对应的cDNA，因为剪接 RNA或cDNA通过例如剪接机制进行处理以除去内含子。基因组核酸任选地包含非转录的 (例如染色体结构序列、启动子区、或增强子区)和/或非翻译的序列(例如内含子)，然而
14剪接RNA/cDNA通常不具备非转录的序列或内含子。“模板核酸”是在扩增反应(例如基于 聚合酶的扩增反应如PCR、连接酶介导的扩增反应如LCR、转录反应等)中起到模板作用的 核酸。模板核酸可为基因组起源的，或者可来源于表达序列如cDNA或EST。“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单 链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸” 是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、和磷酸基组成。核苷酸 (通常以它们的5'单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代“A”为腺苷酸 或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱 氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C 或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。“外源核酸”指针对序列、基因组位置、或两者的，不是原产于指定体系(例如种质、 植物、或品种)的核酸。如本文所用，应用于多核苷酸或多肽的术语“外源的”或“异源的” 通常指已经被人工供给生物系统(例如研究的植物细胞、植物基因、特定植物物种或品种 或植物染色体)的分子，并且所述分子不是该特定生物系统自有的。该术语能够指示从除 天然存在来源之外的来源获取的有关材料，或者能够指具有非天然构型、遗传位置或部件 排列的分子。与之相反，例如“天然的”或“内源的”基因是不包含由除染色体或其他遗传因子 之外的来源编码的核酸元件的基因，在所述染色体或其他遗传因子上内源基因通常天然存 在。内源基因、转录物或多肽由其天然染色体座位编码，并且不被人工供给于细胞。关于核酸或多肽的术语“重组体”指示该材料(例如重组核酸、基因、多核苷酸、或 多肽)已经被人工干预改变。重组分子部分的排列一般不是天然构型，或者重组多核苷酸 或多肽的一级序列已经在某些方面被操纵了。可在材料的天然环境或状态下、或使其脱离 天然环境或状态，对所述材料进行改变以产生重组材料。例如如果在获取天然存在核酸的 细胞中通过人工干预使得天然存在的核酸发生变化，或者转录出该核酸的DNA已经发生了 变化，该核苷酸变成重组核酸。如果核苷酸序列已经从其天然环境中移除并被克隆进任何 类型的人工核酸载体中，该基因序列开放阅读框是重组体。制备重组分子尤其是重组核酸 分子的规程和试剂是本领域常见的和常规的。在一个实施方案中，可制备人工染色体并通 过本领域已知的任何方法将其插入玉米植物中(例如直接递送方法如PEG诱导的DNA摄 入、原生质体融合、显微注射、电穿孔、以及基因枪轰击)。人工染色体是一条可稳定复制并 沿着内源染色体分离的DNA。它具有容纳并表达该处插入的异源基因的能力。将异源DNA 整合到大复制区域(着丝粒的主要复制起始位点)中或与其足够接近，启动兆碱基大小的 染色体片段的大规模扩增，这导致重新形成染色体。参见例如美国专利6，077，697，该专利 以引用方式并入本文。术语重组体也可指包含重组材料的生物，如包含重组核酸的植物被认为是重组植 物。在一些实施方案中，重组生物体是转基因生物体。当涉及将异源或外源核酸转位到细胞中时，术语“导入”指使用任何方法将核酸掺 入细胞。该术语包括核酸导入方法如“转染”、“转化”、和“转导”。如本文所用，术语“载体”用于指将核酸片段转运到细胞中的多核苷酸或其他分 子。术语“运载体”有时与“载体”互换使用。载体任选地包含介导载体维持和使其发挥预
15期用途的部分(例如复制必需的序列、赋予药物或抗生素抗性的基因、多克隆位点、或者可 操作地连接的使得克隆基因能够表达的启动子/增强子元件)。载体通常来源于质粒、噬 菌体、或者植物或动物病毒。“克隆载体”或“穿梭载体”或“亚克隆载体”包含可操作地连 接的部分，所述部分有利于亚克隆步骤(例如包含多个限制性内切核酸酶位点的多克隆位 点)ο如本文所用，术语“表达载体”指包含可操作地连接的多核苷酸序列的载体，所述 多核苷酸序列有利于在特定宿主生物中表达编码序列(例如细菌表达载体或植物表达载 体)。有利于在原核生物中表达的多核苷酸序列通常包括例如启动子、操纵子(任选的)、 和核糖体结合位点、通常还包括其他序列。真核细胞能够使用启动子、增强子、终止和聚腺 苷酸化信号、以及一般不同于原核生物使用的那些序列的其他序列。术语“转基因植物”指在其细胞中包含异源多核苷酸的植物。异源多核苷酸一般 被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或 作为重组表达盒的部分整合进基因组中。本文所用的“转基因”包括因异源核酸存在而已 经改变了基因型的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括初始进行此类 改变的转基因以及从初始的转基因生物或细胞通过杂交或无性繁殖产生的那些转基因生 物或细胞。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法(如杂交)或通过诸 如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发 生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。“定位克隆”是一种克隆方法，其中靶核酸通过它与标记核酸的基因组接近程度被 鉴定并分离。例如基因组核酸克隆能够包括部分或全部两个更多的彼此紧密连锁的染色体 区域。如果可使用标记从基因组文库中鉴定基因组核酸克隆，能够使用标准方法如亚克隆 或测序来鉴定和/或分离靠近标记的克隆的亚序列。当指定核酸使用给定核酸的序列进行构建时，或者当指定核酸使用给定核酸进行 构建时，该指定核酸“来源于”给定核酸。例如，cDNA或EST来源于表达mRNA。术语“遗传因子”或“基因”指具有功能意义的DNA的可遗传序列，即基因组序列。 也可使用术语“基因”指例如cDNA和/或由基因组序列编码的mRNA，以及该基因组序列。术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观 察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已 经从其亲本中继承了所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组 成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中 的所有基因的基因组成。“单倍型”是个体在多个基因座上的基因型。单倍型描述的基因座通常是物理上和 遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指在特定基因座的多态性，如单 标记座位，或者在沿染色体片段的多个基因座上的多态性。前者也可被称为“标记单倍型” 或“标记等位基因”，而后者可被称为“远程单倍型”。术语“表型”或“表型性状”或“性状”指生物的一个或多个性状。表型可用肉眼或 者本领域已知的任何其他评估手段观察到，例如显微镜法、生物化学分析、基因组分析、或 用于特定病害耐受性的检测分析法。在某些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即 “单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。
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“分子表型”是在一组(一个或多个)分子水平上可检测的表型。此类分子可为核 酸如基因组DNA或RNA、蛋白、或代谢物。例如，分子表型可为一种或多种基因产物的表达 谱，例如在植物发育的特定阶段，响应于环境条件或胁迫等的基因产物。表达谱通常在RNA 或蛋白水平上评估，例如在核酸阵列或“芯片”上评估或者使用抗体或其他结合蛋白进行评 估。“代表性样品”是涵盖采样种群的相关组合物和特性的样品。“着丝粒”是在每个染色体上的单个位点，用于在有丝分裂和减数分裂过程中的着 丝粒装配和正确的染色体分离。术语“产量”指具有商业价值的特定植物产品每单位面积的产量。例如玉米产量 一般以每季每英亩种子蒲式耳数或每季每公顷种子公吨数来测量。产量受遗传和环境因素 的影响。“农学”、“农学特性”、和“农学性能”指给定植物品种的性状(以及产生性状的遗 传因子)，所述性状有助于经过生长期的产量。单个农学特性包括出苗活力、营养势、胁迫耐 受性、病害抗性或耐受性、除草剂抗性、发生分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、抗倒 伏性、脱粒率等。因此产量是所有农学特性的最终结果。一“组”标记或探针指标记或探针、或由此获得的数据的一个集合或组，它们用于 常见目的，例如鉴定具有期望性状的玉米植物(例如GLS耐受性)。很多情况下，对应于标 记或探针的数据、或者来源于它们的应用的数据，被储存在电子介质中。当一组的每个成员 具有针对特定目的的效用时，从包括一些但不是全部标记的所述组以及亚组中选择的单个 标记对达到特定目的也是有效的。“遗传特征图”是对特定性状或基因座的序列特征的鉴定和表征。“查找表”是将一种形式的数据与另一种形式的数据关联，或者将一种或多种形式 的数据与该数据相关的预测结果关联的表。例如，查找表能够包括等位基因数据和预测的 包含给定等位基因的植物可能显示的性状间的相关性。这些表可为并且通常为多维的，例 如同时考虑多个等位基因并且也任选地考虑其他因素，例如遗传背景如进行性状预测。“重叠群”指来源于单一基因来源的一组重叠DNA片段。重叠群图谱描述了 代表延长染色体片段的重叠群的连锁文库的相对顺序。“公开重叠群”是公开可用的 一组重叠DNA片段，它们来源于单一基因来源。公开来源的实例包括Maize Mapping Project (University ofMissouri-Columbia、University of Georgia、禾口 University of Arizona)、Arizona Genomics Institute、MaizeGDB 网站、以及 Maize Sequence 网站。序 列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游或下游序列。这些新序列靠近本 文所述的标记，然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和/或基因图 谱进行比对以定位等同标记，所述标记不在所述公开中描述，但是位于相似区域内。这些图 谱可在玉米物种中，或者甚至包括已经与玉米进行了遗传上或物理上的比对的其他物种， 如大米、小麦、大麦、或高粱。可用LASARGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的 Megalign 程序 进行序列比对和相似度百分比计算。用带默认参数(空位罚分=10，空位长度罚分=10) 的Clustal比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS 5 151-153 (1989))进行序列的多重比对。 用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE = 1、空位罚分=3、窗口(WINDOW) = 5和DIAG0NALSSAVED = 5。就核酸而言，这些参数为空位罚分=10，空位长度罚分=10，KTUPLE = 2，空位罚分=5，窗口 = 4，和DIAGONALS SAVED =4。氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”包含足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸 序列以提供该多肽或基因的推定鉴定，所述序列可由本领域技术人员来人工评估，或使用 计算机自动化的序列比较和鉴定工具进行评估，所述工具使用算法如BLAST (Altschul， S. F.等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1993))和 Gapped Blast (Altschul, S. F.等人， Nucleic AcidsRes. 25 :3389_3402 (1997))。可使用 BLASTN 程序进行 BLAST 核苷酸搜索， 得分=100，字长=12，以获取与编码本实施方案的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。 可使用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，得分=50，字长=3，以获取与本实施方案的多 肽同源的氨基酸序列。为了获取用于比对目的的空位比对，可利用Gapped BLAST (BLAST 2. 0)，如 Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 3389.作为另外一种选择，可使用 PSI-BLAST (BLAST 2. 0)进行重复搜索，它检测分子间的较远关系。参见Altschul等人 (1997)同上。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用相应程序(例如用于核 苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默认参数。也可通过检查进行手动比对。“电脑可读介质”是一种信息存储介质，使用电脑可用的或定制的接口可对之进行 存取利用。实例包括存储器(例如R0M、RAM、或闪存)、光存储介质(例如CD-ROM)、磁存储 介质(电脑硬盘、软盘等)、穿孔卡片、以及许多其他可商购获得的存储介质。信息可在受关 注的系统和电脑之间传递，或者传递到电脑及用于存储或获取存储信息的电脑可读介质上 或者从中获取信息。这种传递可为电传递，或者可通过其他可用方法如IR连接、无线连接 等进行。“系统说明书”是可被系统部分或完全执行的说明书。说明书通常以系统软件形式存在。附图和序列简述根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描 述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母 表示氛基酸，如 Nucleic AcidsResearch 13 :3021_3030 (1985)禾口 Biochemical Journal 219 (No. 2) =345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并 入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的 规定。

图1示出在IBM2 2004 neighbors染色体4图谱上的PHJEP GLSQTL的最终位置。 距离单位为CM0图2示出在第二轮作图后，在IBM2 2004 neighbors染色体4图谱上的GLS QTL 的特写图。在第二轮QTL作图中使用加框的标记。箭头显示在该第二轮QTL作图后的QTL 区域。黑色框示出精细作图后的最终QTL位置。图3示出精细作图后的GLS QTL图谱位置。图4A-F示出序列BAC的物理图谱排列(获取自Maize GenomeBrowser,它在因特 网上公开可用；网址为http://www. maizesequence. org)，所述序列BAC在包含GLS QTL的 染色体4区域中。图5示出GLS QTL渗入到PHN46中的过程。深灰色指示PH14T起点。水平线指示 PHN46起点。对角线指示重组区域。*UMC1299位置来自IBM2 Neighbors框图谱一与物理图谱位置一致。图6示出PHN46(左)、PH14T(中)和PHJEP(右)中的GLS病害抗性水平。图7示出以下杂交体的GLS病害抗性水平A)具有QTL渗入的Pioneer杂交体， 它通过杂交自交体PHP38和PHJEP制备，和B)不具有QTL渗入的Pioneer杂交体3394。图8示出GLS QTL进一步渗入到优良材料中的过程。深灰色指示PH14T起点。水 平线指示PHN46起点。对角线指示PHJEP和新的优良种质之间的重组。圆点指示PH14T和 PHN46之间的重组。无阴影部分指示新的优良种质PHVNV、PHEHG, PHW3Y、PHEWB、或PHWRC。图9提供基因组和SSR标记的列表，包括那些证明与GLS耐受性表型连锁不平衡 的标记(从基因图谱中直接或通过外推法得到)。该表提供用于SSR标记座位基因型分析 的左和右PCR引物序列。也显示在SSR的串联重复元件中的核苷酸数目。图10提供列出证明与GLS耐受性表型连锁不平衡的SNP标记。该表提供用于生 成包含SNP的扩增子的PCR引物的序列。序列描述以及关联的序列表遵循如37 C. F R. § 1. 821-1. 825中所列出的管理专 利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母 码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)以及在 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)中描述，这两 篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R. § 1.822中列出的规则。SEQ ID N0:liPSEQ ID NO :2 是设计用于扩增 BAC 末端 bacm2. pk027. hlO. f■的引物。SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 是设计用于扩增 BAC 末端 bacm. pk098. d7 的引物。SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 是设计用于扩增 BAC 末端 bacm. pkl06. j3 的引物。SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 是设计用于扩增 BAC 末端 bacm. pk018. hl5 的引物。SEQ ID NO :9 禾口 SEQ ID NO :10 是设计用于扩增 BAC末端bacm. pk040. ol7 的引物。 该引物对代表本文称为PHM 00045的CAPs标记。SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO 12 是设计用于扩增 BAC 末端 bacm2. pk065. b22. f 的 引物。SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 是设计用于扩增 BAC 末端 bacb. pk0333. ol9 的引 物。该引物对代表本文称为PHM 00043的CAPs标记。SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 是设计用于扩增 BAC 末端 bacc. pk0267. ml2. f 的 引物。SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO 18 是设计用于扩增 EST 横穿(overgo)探针 cl33021_l 的引物。SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 20 是设计用于扩增 BAC 末端 bacb. pk0241. hl7. f 的 引物。SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO 22 是设计用于扩增克隆 chp2. pk0007. d2 的引物。SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 是设计用于扩增 BAC 末端 bacc. pk0530. f 13. f 的 引物。SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 是设计用于克隆 p0094. csstg88 的引物。
19SEQ ID N0:27禾口 SEQ ID NO :28是设计用于扩增BAC末端bacb. pk0269. nl9的弓丨 SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO :30 是设计用于扩增 BAC 末端 bacb. pk0009. b21. f 的 SEQ ID N0:31 和 SEQ ID NO :32 是设计用于扩增 BAC 末端 bacb. pk0117. i09. f 的 SEQ ID N0:33禾口 SEQ ID NO :34是设计用于扩增BAC末端bacc. pk0280. nl2的弓丨 SEQ ID NO 35 和 SEQ ID NO 36 是设计用于扩增 BAC 末端 bacb. pk0219. j20 的引 SEQ ID N0:37 禾口 SEQ ID NO :38 是设计用于扩增 BAC 末端 bacc. pk0132. bl6. f 的 SEQ ID N0:39禾口 SEQ ID NO :40是设计用于扩增BAC末端bacb. pk0221. o22的弓丨 SEQ ID N0:41禾口 SEQ ID NO :42是设计用于扩增BAC末端bacb. pk0544. jl8的弓丨 SEQ ID NO 43 和 SEQ ID NO 44 是设计用于扩增 BAC 末端 bacb. pk0540. cl8. f 的 SEQ ID N0:45禾口 SEQ ID NO :46是设计用于扩增BAC末端bacm. pk022. b8的引物。物。引物。引物。物。物。引物。物。物。引物。
该引物对代表本文称为PHM 00049的CAPs标记。SEQ ID NO 47 和 SEQ ID NO 48 是用于标记座位 PHM 7245 的引物。SEQ ID NO :49是分类为LRR样蛋白激酶型的推定R基因的注解核苷酸序列。SEQ ID NO 50是由SEQ ID NO 49编码的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:51 是 PHM 15534-13 正向引物的序列。SEQ ID N0:52 是 PHM 15534-13 反向引物的序列。SEQ ID NO :53 是 PHM 15534-13 探针 1 的序列。SEQ ID N0:54 是 PHM 15534-13 探针 2 的序列。SEQ ID N0:55 是 PHM 15534 参比序列的序列。SEQ ID N0:56 是 PHM 04694-10 正向引物的序列。SEQ ID N0:57 是 PHM 04694-10 反向引物的序列。SEQ ID NO :58 是 PHM 04694-10 探针 1 的序列。SEQ ID NO :59 是 PHM 04694-10 探针 2 的序列。SEQ ID N0:60 是 PHM 04694-10 参比序列的序列。SEQ ID N0:61 是 PHM 01811-32 正向引物的序列。SEQ ID N0:62 是 PHM 01811-32 反向引物的序列。SEQ ID N0:63 是 PHM 01811-32 探针 1 的序列。SEQ ID N0:64 是 PHM 01811-32 探针 2 的序列。SEQ ID N0:65 是 PHM 01811-32 参比序列的序列。SEQ ID N0:66 是 PHM 01963-15 正向引物的序列。0174]SEQIDNO67是PHM 01963-15反向引物的序列。0175]SEQIDNO68是PHM 01963-15探针1的序列。0176]SEQIDNO69是PHM 01963-15探针2的序列。0177]SEQIDNO70是PHM 01963-15参比序列的序列。0178]SEQIDNO71是PHM 01963-22正向引物的序列。0179]SEQIDNO72是PHM 01963-22反向引物的序列。0180]SEQIDNO73是PHM 01963-22探针1的序列。0181]SEQIDNO74是PHM 01963-22探针2的序列。0182]SEQIDNO75是PHM 01963-22参比序列的序列。0183]SEQIDNO76是PHM 05013-12正向引物的序列。0184]SEQIDNO77是PHM 05013-12反向引物的序列。0185]SEQIDNO78是PHM 05013-12探针1的序列。0186]SEQIDNO79是PHM 05013-12探针2的序列。0187]SEQIDNO80是PHM 05013-12参比序列的序列。0188]SEQIDNO81是PHM 00586-10正向引物的序列。0189]SEQIDNO82是PHM 00586-10反向引物的序列。0190]SEQIDNO83是PHM 00586-10探针1的序列。0191]SEQIDNO84是PHM 00586-10探针2的序列。0192]SEQIDNO85是PHM 00586-10参比序列的序列。0193]SEQIDNO86是标记bnlgl755的左引物的序列。0194]SEQIDNO87是标记bnlgl755的右引物的序列。0195]SEQIDNO88是标记umC156a的左引物的序列。0196]SEQIDNO89是标记umC156a的右引物的序列。0197]SEQIDNO90是标记umcll42的左引物的序列。0198]SEQIDNO91是标记umc 1142的右引物的序列。0199]SEQIDNO92是标记umcl346的左引物的序列。0200]SEQIDNO93是标记umc 1346的右引物的序列。0201]SEQIDNO94是标记umcl702的左引物的序列。0202]SEQIDNO95是标记umcl702的右引物的序列。0203]SEQIDNO96是标记mmc0371的左引物的序列。0204]SEQIDNO97是标记mmc0371的右引物的序列。0205]SEQIDNO98是标记bnlgl621a的左引物的序列。0206]SEQIDNO99是标记bnlgl621a的右引物的序列。0207]SEQIDNO100是标记umcl299的左引物的序列。0208]SEQIDNO101是标记umcl299的右引物的序列。0209]SEQIDNO102是PHM 00045参比序列的序列。0210]SEQIDNO103是PHM 00049参比序列的序列。0211]发明详述0212]使用MAS鉴定并选择显示GLS耐受性的玉米植物能够提供有效的和环境友好的方
21法以减少这种病害引起的损失。本发明提供玉米标记座位，所述标记座位显示统计意义上 显著性的GLS耐受性共分离。能够在标记辅助的玉米育种程序中检测这些基因座或附加的 连锁基因座以制备耐受性植物或具有改善的GLS耐受性的植物。本文鉴定的连锁SSR和 SNP标记在下文和图中提供。这些标记包括PHM 15534、PHM04694、PHM 0181UPHM 01963、 PHM 05013、和 PHM 00586 (图 10)。每个SSR型标记显示多个等位基因，所述等位基因可被视为不同大小的PCR扩增 子。用于生成SSR标记扩增子的PCR引物在图9中提供。SNP型标记的等位基因使用等位 基因特异性的杂交规程进行测定，该规程是本领域已知的。用于扩增SNP结构域的PCR引 物在图10中提供本领域认识到与QTL标记连锁的任何其他标记(例如病害耐受性标记)也发现用 于相同目的。提供了与本文所述的病害耐受性标记连锁的附加标记的实例。例如可从表3 提供的紧密连锁中测定连锁标记。然而并不意味着本发明使用的连锁标记受表3所述的那 些标记的限制。本发明也提供与GLS耐受性关联的染色体QTL区间。这些区间位于连锁群4上。将 位于这些区间内的任何标记用作GLS耐受性标记。这些区间包括(i)BNLG1755和UMC1299， (ii)BNLG1755 和 BNLG1621A， (iii)BNLG1755 和 MMC0371， (iv)BNLG1755 和 UMC1702， (ν) UMC156A 和 UMC1299，(vi)UMC156A 和 BNLG1621A，(vii)UMC156A 和 MMC0371，(viii)UMC156A 和 UMC1702， (ix)UMCl142 和 UMC1299， (x)UMCl142 和 BNLG1621A， (xi)UMCl142 和 MMC0371， (xii)UMC1142 和 UMC1702， (xiii)UMC1346 和 UMC1299， (xiv)UMC1346 和 BNLG1621A， (xv) UMC1346 和 MMC0371，以及(xvi)UMC1346 和 UMC1702。本发明还提供由PHM 00043 (SEQ ID NO 102)和 PHM 00049 (SEQID NO 103)限定 并包括它们的邻接DNA区域，其中包含与GLS耐受性共分离的标记座位(图4)。可使用位 于DNA邻接片段内的任何标记座位作为GLS耐受性标记，所述DNA邻接片段位于以下两个 核苷酸序列之间并包括它们SEQ ID NO :102，或者基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 102具有95%同一性的核苷酸序列，以及SEQ IDNO 103，或者基于Clustal V比对方法与 SEQ ID NO 103具有95%同一性的核苷酸序列。鉴定携带优选耐受性标记座位的等位基因的玉米植物或种质的方法是本发明的 一个特征。在这些方法中，取决于标记座位的类型，可使用多种标记检测规程中的任何一种 来鉴定在标记座位的等位基因。一般检测方法包括ASH、SSR检测、RFLP分析、以及多种其 他方法。虽然特定标记等位基因可显示与病害耐受性表型或易感性表型的共分离，但重要 的是注意到标记座位是导致耐受性或易感性的QTL基因座非必需的部分。例如不需要标记 多核苷酸序列是赋予病害耐受性的基因的部分(例如是基因开放阅读框的部分)。在耐受 性或易感性等位基因从中起源的祖先玉米品系中，特定标记等位基因与耐受性或易感性表 型的关联是由于标记等位基因和QTL耐受性或易感性等位基因之间的最初“相引”相连锁。 最后通过反复重组，标记和QTL基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原 因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用 于制备分离种群。这不改变可使用遗传标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离 种群中认为哪个标记等位基因是有利的。
鉴定包含与改善耐受性关联的标记等位基因的玉米植物或种质提供了进行玉米 标记辅助选择的基础。选择包含有利标记等位基因的玉米植物，而不选择包含与耐受性负 相关的标记等位基因的玉米植物。可将期望的标记等位基因渗入具有期望(例如优良的或 外来的)遗传背景的玉米以生成渗入耐受性的玉米植物或种质。在某些方面，预期多个耐 受性标记等位基因被连续或同时选择和/或渗入。可在单个植物中用于选择耐受性的耐受 性标记的组合不受限制，并且能够包括图3所述标记、与图3所述标记连锁的任何标记、或 者位于本文限定的QTL区间中的任何标记的任何组合。作为将受关注的性状导入玉米的标准育种方法(例如基因渗入)的替代方法，也 可使用转基因方法。在这些方法中，可将控制受关注性状如病害耐受性的外源核酸导入靶 植物或种质中。耐受性确认能通过可用的耐受性规程进行(例如如上文所述)。使用耐受 性检测分析法确认在任何特定植物或种群中耐受性性状仍与标记一起分离，并且当然测量 通过将性状渗入或转基因导入期望背景获得的耐受性改善程度。在一个一分至九分的评 分等级中，包含灰叶斑病QTL的有利等位基因的植物可具有的耐受性评分为至少2. 7,2. 6、 2. 5,2. 4,2. 3,2. 2,2. 1,2. 0,1. 9,1. 8、或1. 7分，其评分在与不包含灰叶斑病QTL的有利等 位基因的近等基因植物进行比较时更高。在一个1至9的视觉评分系统中，评分越高指示 抗性越高。仅当在测量实验中存在足够的选择压力时，数据将被收集。包括用于选择包含受关注标记的植物和/或用于将存在的标记与耐受性关联的 自动化系统的系统也是本发明的一个特征。这些系统可包括与标记座位检测有关的探针、 用于检测探针上标记的检测器、混合探针与模板和/或扩增模板的合适流体处理元件和温 度控制器、以及将标记检测与特定标记座位或等位基因存在关联的系统说明书。试剂盒也是本发明的一个特征。例如试剂盒可包括用于检测耐受性关联的标记 座位的合适的引物或探针，以及使用所述引物或探针来检测标记座位并将基因座与预测的 GLS耐受性关联的说明书。该试剂盒还可包括包装探针、引物、或说明书的包装材料、对照物 如包括用于扩增的探针、引物或模板核酸的对照扩增反应、分子量标记等。耐受性标记和有利等位基因在传统的连锁分析中，不需要直接知道染色体上基因的物理关系。孟德尔第一定 律是控制成对性状的因子会分离，意指成对性状的等位基因分离到两个配子中去，然后进 入不同的子代。可将经典的连锁分析认为是对不同性状的共分离相对频率的统计学描述。 连锁分析是关于性状如何基于它们共分离的频率集合的表征良好的描述性结构。即，如果 两个非等位性状以大于随机频率的频率被一起继承，将它们称为“连锁的”。性状被一起继 承的频率是性状连锁紧密程度的主要量度，即以较高频率被一起继承的性状比以较低频率 (但仍高于随机频率)被一起继承的性状连锁更紧密。性状连锁是因为导致该性状的基因 位于相同染色体上。基因在染色体上的位置越分散，它们共分离的可能性越低，因为同源染 色体在减数分裂期间重组。因此基因在染色体上分散的越远，在减数分裂期间将发生会导 致两个基因分开地分离到子代中的交换事件的可能性越大。连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可能以共分离百分比(重组频率)表示， 或者也常见地以厘摩(cM)表示。cM以先驱遗传学者Thomas Hunt Morgan命名，是遗传重 组频率的量度单位。一 cM等于由于在一代中的交换导致的在一个基因座上的性状将与在 另一个基因座上的性状分离的概率为(意味着性状99%的情况下共分离)。因为染色
23体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重组频率关联的近似物理距离。标记座位本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记座位、根据标准连锁分 析进行评估。因此在本发明的情况下，一 cM等于由于在一代中的交换导致的标记座位将 与另一个基因座(它可为任何其他性状，例如另一个标记座位，或另一个编码QTL的性状 基因座)分离的概率为1%。本文标记参见图3，例如PHM 15534, PHM 04694、PHM01811、 PHM 01963、PHM 05013、和 PHM 00586，以及任何染色体区间(i) BNLG1755 和 UMC1299，(ii) BNLG1755和BNLG1621A， (iii)BNLG1755和 MMC0371， (iv)BNLG1755和 UMC1702， (v)UMC156A 和 UMC1299， (vi)UMC156A 禾Π BNLG1621A, (vii)UMC156A 禾Π MMC0371, (viii)UMC156A 和 UMC1702, (ix)UMC1142 和 UMC1299， (x)UMC1142 和 BNLG1621A， (xi)UMC1142 和 MMC0371， (xii)UMC1142 和 UMC1702， (xiii)UMC1346 和 UMC1299， (xiv)UMC1346 和 BNLG1621A， (xv) UMC1346和MMC0371，以及(xvi)UMC1346和UMC1702，已经发现它们与新赋予的耐受性、提高 的耐受性、或玉米GLS易感性关联。这意味着标记与耐受性性状的连锁足够紧密使得它们 可被用作耐受性性状的预报。这在本文详述的标记辅助选择(MAS)中是非常有用的。简而 言之，能够选择标记等位基因与耐受性正相关的玉米植物或种质，实际上不种植玉米并测 量新赋予的耐受性或提高的耐受性(或者相反地，如果玉米植物具有与新赋予的耐受性或 提高的耐受性负相关的标记，可不选择它们)。MAS是一种选择期望表型并将期望性状渗入 玉米栽培变种(例如将期望性状渗入优良品系)的强大快捷工具。MAS容易适应高通量的 分子分析方法，该方法可迅速筛选大量植物或种质遗传材料的受关注的标记，并且比种植 植物并观察其可见性状的方法的性价比高得多。在一些实施方案中，QTL标记是图3提供的标记的亚群，例如设计用于bacb. pk0333. ol9 (例如 PHM 00043)、bacc. pk0267. ml2. f、cl33021_l、bacb. pk0241. hl7. f、 chp2. pk0007. d2、p0094. csstg88、bacb. pk0269. nl9、bacb. pk0009. b21. f、bacb. pk0117. i09. f、bacc. pk0280. nl2、bacb. pk0219. j20、bacc. pk0132. bl6. f、bacb. pk0221. o22、bacb. pk0544. j 18, bacb. pk0540. cl8. f、和 bacm. pk022. b8 (例如 PHM00049)的标记。当涉及两个遗传因子间的关系时，如有助于产生耐受性和紧密关联标记的遗传因 子，则“耦合”相连锁指示下述状态其中在耐受性基因座上的“有利”等位基因与相应连锁 的标记座位的“有利”等位基因物理上附连在相同染色体链上。在耦合相中，两个有利等位 基因被继承了该染色体链的子代一起继承。在“相斥”相连锁中，在受关注基因座上的“有 利”等位基因(例如QTL耐受性)与在紧密连锁标记座位上的“不利”等位基因物理上连 锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。标记的有利等位基因是与期望表型(例如病害耐受性)共分离的标记的等位基 因。如本文所用，虽然所述标记具有两个或更多个存在于种群中的有利等位基因是可能的， QTL标记具有最少一个有利等位基因。任何该标记的有利等位基因可被有利地用于鉴定和 构造耐受性玉米品系。任选地在植物中鉴定不同标记的一个、两个、三个或更多个有利等位 基因，或者将它们渗入植物，并且它们在MAS期间可进行选择。期望鉴定具有至少一个此类 有利等位基因的植物或种质，所述有利等位基因与新赋予的或提高的耐受性正相关。作为另外一种选择，也发现与病害易感性关联的标记等位基因用于本发明，因为 该等位基因可用于鉴定并反选择病害易感植物。在育种期间此种等位基因可用于排除目的 以鉴定具有与耐受性负相关的等位基因的植物或种质，从而从随后若干轮的育种中除去易感植物或种质。在本发明的一些实施方案中，同时选择多个标记等位基因用于单个植物或一组植 物。在这些方法中，选择的植物包含GLS耐受性的有利等位基因，或者将GLS耐受性的有利 等位基因渗入期望的玉米种质中。本领域的技术人员认识到在相同植物中同时选择GLS耐 受性的有利等位基因可能导致对植物附加的(或甚至协同的)保护效应。技术人员认识到在某些情况下有利标记等位基因的鉴别是种质特异性的。测定所 研究的特定种质以确定哪些标记等位基因与耐受性(或易感性)关联。技术人员认识到用 于鉴定有利等位基因的方法是常规的并且是本领域熟知的，此外鉴定和使用此类有利等位 基因属于本发明的范围内。此外鉴定除本文使用的或描述的种群之外的玉米种群中的有利 标记等位基因属于本发明的范围内。用于扩增SSR型标记座位的扩增引物是本发明的特征。本发明的另一个特征是特 异用于扩增SNP结构域(SNP标记)的引物，以及用于检测SNP序列的探针。图9和10提 供了用于标记座位扩增的特异引物和用于检测扩增标记座位的探针。然而技术人员将立即 认识到可使用给定引物的任一侧的其他序列代替给定引物，只要该引物能够扩增包括将被 检测的等位基因的区域。此外应当理解用于检测的精确探针能够改变，例如能鉴定将被检 测的标记扩增子区域的任何探针可被本文提供的那些实例取代。此外扩增引物和检测探针 的构型当然能够改变。因此本发明不受本文所述的引物和探针的限制。在某些方面，本发明的方法利用扩增步骤以检测/确定标记座位基因型。然而应 当理解标记检测不需要扩增，例如人们能够通过简单地对基因组DNA样品进行Southern 印迹直接检测未扩增的基因组DNA。已经确定并提出了进行Southern印迹、扩增(PCR、 LCR等)以及多种其他核酸检测方法的过程，例如Sambrook等人，Molecular CloninR-A Laboratory Manual(第 3 片反)，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,2000 ( “Sambrook”)；Current Protocolsin Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人编辑，Current Protocols, a jointventure between Greene Publishing Associates,Inc. and John Wiley&Sons,Inc. ,(supplemented through 2002) (“Ausubel”) 禾口 PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications (Innis 等人编辑)Academic Press Inc. San Diego，CA(1990) (“Innis”)。关于检测植物中的核酸的附加细节也可参 见例如 Plant Molecular Biology (1993)Croy (编辑)BIOSScientific Publishers, Inc. (“Croy，，)。在扩增/检测方法中也可省略分离检测探针，例如通过进行实时扩增反应，该反 应通过当掺入产物时改变相关扩增引物、将标记核苷酸掺入扩增子、或通过监控扩增子的 摩尔旋光度特性与未扩增前体相比的变化(例如通过荧光偏振)来检测产物形成。分子标记通常通过任何本领域可用的确立方法进行检测，所述方法不受限制的包 括等位基因特异性杂交(ASH)或其他方法，用于检测单核苷酸多态性、扩增片段长度多态 性(AFLP)检测、扩增可变序列检测、随机扩增多态性DNA(RAPD)检测、限制性片段长度多态 性(RFLP)检测、自主序列复制检测、简单序列重复(SSR)检测、单链构象多态性(SSCP)检 测、酶切扩增多态序列(CAPS)检测、同功酶标记检测等。虽然本文图表中提供的示例性标 记是SSR或SNP (ASH)标记，但是可在本发明的情况下使用任何前述标记类型以鉴定染色体 片段，所述染色体片段包含有助于产生优异农学性能(例如新赋予的耐受性或提高的耐受
25性)的遗传因子。QTL染饩体区间在某些方面，本发明提供QTL染色体区间，其中在那些区间中包含与GLS耐受性关 联的一个或多个QTL。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间(在下文实施例中详 述)。扩展此类染色体区间的边界以包含将与一个或多个QTL连锁的标记。换句话说，扩 展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可被用作病害 耐受性标记。每个区间包含一个GLS QTL，此外甚至可包含一个以上的QTL。相同区间中非 常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示与一个以上的 QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清 楚是否那些标记中的每一个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。本发明提供玉米染色体区间，其中在所述区间内的标记显示与GLS耐受性共分离 (参见表1)。表 权利要求
命名为PHJEP的玉米品种的种子，其中所述玉米品种的代表性样品已经作为ATCC保藏号PTA 8851被保藏，或者得自所述种子的子代种子，所述子代种子包含PHJEP灰叶斑病耐受性基因座，并且当生长时，产生表现出灰叶斑病耐受性的植物。
2.由权利要求1的种子或子代种子产生的植物。
3.权利要求2的植物的植物细胞。
4.权利要求1的子代种子，其中所述PHJEP灰叶斑病耐受性基因座位于PHJEP来源的 染色体区间上，所述染色体区间包含由UMC1346和UMC1702限定的PHJEP的染色体区域。
5.权利要求1的子代种子，其中所述PHJEP灰叶斑病耐受性基因座由单倍型限定，所述 单倍型包含在 PHM 00045-01 上的 G 在 PHM 00043-01 上的 A 在 PHM 15534-13 上的 A 在 PHM 04694-10 上的 G 在 PHM 01811-32 上的 T 在 PHM 01963-15 上的 T 在 PHM 01963-22 上的 C 在 PHM 05013-12 上的 T 在 PHM 00586-10 上的 T 在 PHM 00049-01 上的 A。
6.权利要求1的子代种子，其中所述PHJEP灰叶斑病耐受性基因座由单倍型限定，所述 单倍型包含在 PHM 00045-01 上的 G 在 PHM 00043-01 上的 A 在 PHM 01963-22 上的 C 在 PHM 05013-12 上的 T。
7.权利要求1的子代种子，其中所述子代种子是所述PHJEP灰叶斑病耐受性基因座的 回交转化体。
8.权利要求7的子代种子，其中所述回交转化体用选自PHVNV、PHW3Y、PHVRA,PHEffB, 和PHWRC的轮回亲本产生。
9.权利要求1的子代种子，其中所述子代种子是杂交品种，并且所述杂交品种的至少 一个自交亲本是所述PHJEP灰叶斑病耐受性基因座到选自PHVNV、PHW3Y、PHVRA, PHEWB、和 PHWRC的轮回亲本的回交转化体。
10.用于鉴定包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座的第一玉米植物的方法，所述方法 包括(a)获取所述第一玉米植物在染色体4上BNLG1755和UMC1299之间的染色体区间的第 一遗传特征图，(b)从包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座的第二玉米植物获取第二遗传特征图，其 中所述基因座位于染色体4上BNLG1755和UMC1299之间，和(c)比较所述第一遗传特征图和所述第二遗传特征图。
11.权利要求10的方法，如果所述第一玉米植物包含与灰叶斑病耐受性关联的基因 座，所述方法还包括选择所述第一玉米植物。
12.权利要求10的方法，其中所述第二遗传特征图是PHJEP或PHJEP的子代的遗传特 征图。
13.权利要求10的方法，其中所述第二遗传特征图包含一个或多个选自下组的标记 等位基因在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 15534-13上的等位基因A、在PHM 04694-10上的等位基因G、在PHM 01811-32上的等位基 因T、在PHM 01963-15上的等位基因T、在PHM 01963-22上的等位基因C、在PHM 05013-12 上的等位基因T、在PHM 00586-10上的等位基因T、以及在PHM 00049-01上的等位基因A。
14.权利要求10的方法，其中所述第二遗传特征图包含一个或多个选自下组的标记 等位基因在PHM 00045-01上的等位基因G、在PHM 00043-01上的等位基因A、在PHM 01963-22上的等位基因C、和在PHM 05013-12上的等位基因T。
15.权利要求10的方法，其中将所述第一遗传特征图和所述第二遗传特征图进一步限 定为在染色体4上在BNLG1755和MMC0371之间的染色体区间的遗传特征图。
16.权利要求10的方法，其中与灰叶斑病耐受性关联的基因座是PHM15534、PHM 04694、PHM 01811、PHM 01963、PHM 05013、或 PHM 00586。
17.通过权利要求10的方法鉴定的玉米植物。
18.权利要求17的玉米植物的细胞。
19.权利要求17的玉米植物的种子。
20.用于鉴定包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座的第一玉米植物的方法，所述方法 包括(a)获取所述第一玉米植物在染色体4上的区间中的第一遗传特征图，所述区间由以 下序列描述并且包括以下序列SEQ ID NO :86，或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 86具有95%同一性的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :87，或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO 87具有95%同一性的核苷酸序列；以及(b)从包含与灰叶斑病耐受性关联的基因座的第二玉米植物获取第二遗传特征图，其 中所述基因座位于所述区间中，和(c)比较所述第一遗传特征图和所述第二遗传特征图。
21.包含以下单倍型的玉米种子 在PHM 00045-01上的等位基因G 在PHM 00043-01上的等位基因A 在PHM 15534-13上的等位基因A 在PHM 04694-10上的等位基因G 在PHM 01811-32上的等位基因T 在PHM 01963-15上的等位基因T 在PHM 01963-22上的等位基因C 在PHM 05013-12上的等位基因T 在PHM 00586-10上的等位基因T 在PHM 00049-01上的等位基因A。
22.由权利要求21的玉米种子生产的植物。
23.包含以下单倍型的玉米种子 在PHM 00045-01上的等位基因G 在PHM 00043-01上的等位基因A在PHM 01963-22上的等位基因C，和 在PHM 05013-12上的等位基因T。
24.由权利要求23的玉米种子生产的植物。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定具有对灰叶斑病(GLS)新赋予的耐受性或提高的耐受性、或易感灰叶斑病的玉米植物的方法和组合物。所述方法使用分子遗传标记鉴定、选择和/或构建耐受性植物或鉴定并反选择易感植物。显示对GLS新赋予的耐受性或提高的耐受性的玉米植物也是本发明的一个特征，所述植物通过本发明的方法生成。
文档编号C12N15/82GK101970669SQ200880127682
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月23日 优先权日2007年12月31日
发明者W·A·威尔逊, 李柏林 申请人:纳幕尔杜邦公司;先锋国际良种公司