专利名称：：以斑部位增强基因群为指标的皮肤斑形成预知方法、皮肤斑形成抑制剂的筛选方法
技术领域：
：本发明涉及用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法。
背景技术：
：如果由于紫外线和激素的失衡、精神压力等，黑素细胞(色素形成细胞)内的酪氨酸酶的功能被异常活化，那么黑色素就被连续制造出来并输送到周围的表皮细胞中。一般认为，制造出黑色素的速率加快，且如果由于紫外线等的影响使得代谢更新变得不正常时，黑色素就不能排出到体外而残留在肌肤中，其结果造成肌肤出现斑。如果已经出现了斑，优选尽早进行其处理，所以人们通过依靠美容技术者的视感(视觉)对斑的感官评价，使用皮肤状态的摄像装置、测色计等器械的斑的定量评价，期望实现斑的有无的早期判定(特开2003-144393号公报)。斑一旦形成，其去除就不容易，因此使肌肤的新陈代谢良好，并尽早排出不需要的黑色素，使得不制造出多于的黑色素等的保养是必要的。所以，优选在斑形成前进行肌肤的保养。但是，因为斑形成的容易程度有个体差异，另外成为其原因的条件也多种多样，所以预知斑形成一般来说是困难的。因此，如果有能够在斑形成前预知是否处于容易形成斑的状态的方法，那么这作为斑预防对策就极为有效。釆集表皮正常部位的样品，对于每一个样品，分别有以检测NT-3、ADAM9或HB-EGF为指标，以上述评价为目标的报告(特开2003-245097)。另外，还有具有c-KIT、ET的抑制，以斑对策为目标的报告(特开2004-83551)。但是，只要没有完全阐明斑生成的复杂生物体病理反应，在了解多个色素合成刺激途径的现状下，着眼于少数基因进行斑生成的判断或处理时，是否能够完全解决就令人担心。所以，出现了检测大范围的基因的变化，以这些作为诊断的指标的报告(特开2004-205246)。但是，该报告是用称为SAGE法的方法检测了对皮肤的日光暴露产生的变化基因，目前需要的是基于对于斑本身的广泛分析的判断、处理方法的确立。因此，我们用微阵列比较斑模型小鼠的斑部位和正常部位，查明了斑部位特征性的慢性炎症状态(特开2005-106745、特开2005-110505)。而且，这次通过作为在人类中比较典型的一种斑即老年性色素斑部位与正常部位的比较，除了上述特征之外，还发现了在斑部位的皮脂腺相关基因的增强、角质化相关基因的抑制等。
发明内容本发明人鉴于上述问题，深入研究了能否提供一种方法，该方法能够在肌肤出现斑之前预知肌肤是否处于容易出现斑的状态。而且，本发明人根据老年性色素斑部位与正常对照部位的11例的表皮和真皮上层来源的RNA的微阵列分析的结果，发现了在老年性色素斑部位下述基因的表达特异性地被增强或抑制。所以，明确了在人类的皮肤中，通过检测下述基因的表达，可以判断为是容易形成斑的皮肤。表l(1)脂质相关的增强基因<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2(2)信息传递相关的增强基因<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3(3)表达抑制基因群<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>对上述基因的任一种都不存在皮肤色素相关的报告。所以，在与斑的关系中这些基因的表达增强或者抑制应该是极为惊人的事实。在笫一的观点中，本发明提供用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法。该方法的特征在于，当皮脂腺类基因在表皮中的基因表达比正常表皮中的表达增强的情况时，判断为是容易形成斑的皮肤。这里，所谓斑是指在皮肤上出现的茶褐色至浓褐色的平面状斑紋。其中这里所述的斑主要是指老年性色素斑。在适宜的方案中，在皮脂腺类基因中表达增强的表皮中的基因是编码选自表l的蛋白质的基因。在笫二的观点中，本发明提供用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法，其特征在于，当编码选自表2的蛋白质的基因的表达比正常表皮中的表达增强的情况时，判断为是容易形成斑的皮肤。在第三的观点中，本发明提供用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法，当表3的表达比正常表皮中的表达降低的情况时，判断为是容易形成斑的皮肤。在适宜的方案中，上述表皮中的基因表达的变化可以通过测定表皮中的上迷蛋白质的量来确定。更加适宜的是，上述测定通过利用上述蛋白质特异性抗体的ELISA法或RIA法来进行。在其它适宜的方案中，上述表皮中的上述基因的表达的变化是通过测定从表皮提取的编码上述蛋白质的mRNA的量来确定的。优选的是，上述mRNA的测定通过聚合酶链反应法来进行。在第四的观点中，本发明提供筛选皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子的方法，其特征在于，评价候补化合物抑制或增强上述基因的表达和/或作为其基因产物的蛋白质的活性的能力，将该具有抑制或增强能力的在适宜的方案中，该方法包括将上述具有抑制或增强能力的抑制物或激活物适用于皮肤^^莫型，选定具有皮肤斑形成抑制和/或皮肤斑除去效果的药剂。在第五的观点中，本发明提供美白方法、斑形成抑制方法或斑除去方法，该方法是通过抑制编码选自MLSTD1,MOGATl，FADS2，FADS1，HSD3B1，ELOVL3，BG1，PECR，FABP7，FA2H，HA02，ALOX15B的蛋白质的基因的表达增强的美白方法、斑形成抑制方法或斑除去方法。根据本发明，可以提供用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法。附图简述图1显示了通过脂质类增强基因在皮肤的分布原位杂交得到的脂质类增强基因在斑部位和附近正常部位的表达差异分布的结果。白色箭头部分的深蓝色为检测出信号的表皮部位。显示各个基因在斑部位的表皮都有增强倾向。图2显示了通过角质层构成蛋白质在皮肤内的分布荧光免疫染色得到的角质层构成蛋白质在斑部位和附近正常部位的表达差异分布的结果。白色箭头部分的绿色为检测出信号的颗粒层部位。显示各个基因在斑部位的表皮都有降低倾向。图3表示将角质层层数的比较角质层番红染色后，用碱使之膨胀而可视化，数出角质层层数的结果。照片表示其一例。将6个样品的各4处的角质层层数的平均值示于图表中。显示在斑部位比附近正常部位的角质层层数多。图4表示增殖细胞数的比较。详细地说，表示通过特异性地染色分裂期的细胞的Ki-67抗体比较在斑部位和附近正常部位的分裂细胞的结果。显示了3例的荧光免疫染色照片，显示在斑部位阳性细胞少。因为显示该荧光并不被黑色素所掩盖，所以显示了与透射光图像的结合图片。进一步数出每lmm组织的阳性细胞数，归納于图中。其平均值显示在斑部位增殖细胞显著较少。具体实施例方式如上所述，关于上述基因，不存在皮肤色素相关的^L告。本发明者根据老年性色素斑部位与正常部位各个皮肤来源的RNA的微阵列分析的结果，发现了与非斑部位相比，在斑部位的表皮上述各基因的表达特异性地增强或抑制。所以可以推测，通过以这些基因为指标，能够预知皮肤斑形成。用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法
技术领域：
：本发明提供用于预知皮肤斑优选是人类皮肤斑形成的皮肤检查方法。该方法的特征在于，在对象表皮中的选自表l、2、3的基因的表达比正常表皮中的表达增强或降低的情况下，判断为是容易形成斑的皮肤。作为该评价基准，例如，如果表皮中的上述基因的表达比对照表皮中的表达增强10%以上，或20%以上，或30%以上，或50%以上，或70%以上，或100%以上，那么就可以判断为"是容易形成斑的皮肤，，。应该检查的皮肤可以是，例如脸、颈、手臂、四肢、背部等容易形成斑、或担心形成斑的所有部分的表皮。作为不形成斑的正常表皮，即对照表皮，例如可以是同一个体的斑附近正常部位、难暴露于紫外线而比较难形成斑的部位的表皮，例如腹部、贅部的表皮。从表皮采集样品的方法可以根据检测对象和检测方法的种类按照常规方法采集，优选依照活组织检查的方法釆集。表皮中的上述基因的增强或抑制，例如通过测定表皮中该基因所编码的蛋白质的量来确定。优选的是，该测定利用上述蛋白质特异性抗体，通过在本领域内周知的方法，例如利用荧光物质、色素、酶等的免疫染色法，蛋白印迹法，免疫测定法例如ELISA法、RIA法等各种各样的方法来实施。另外，也可以通过从表皮提取RNA,测定编码该基因的mRNA的量来确定。mRNA的提取、其量的测定在本领域内是周知的，例如RNA的定量可以通过定量聚合酶链反应法(PCR)来进行。在高严格条件下能够对表皮中的上述基因杂交的多核苷酸的表达，也可以通过从表皮提取RNA,测定对应于上述多核苷酸的mRNA的量来确定。mRNA的提取、其量的测定在本领域内也是周知的，例如RNA的定量可以通过定量聚合酶链反应法(PCR)来进行。如上所述，本发明基于以下发现，根椐斑部位和非斑部位的各个皮肤来源的RNA的微阵列分析的结果，发现了与非斑部位相比，在斑部位的表皮上述基因的表达特异性地增强或抑制。所以可以推测，以抑制或增强标，可以进行能够抑制皮肤的斑形成和/或除去形成的斑的药剂的开发。所以，本发明提供医药或皮肤外用组合物，其含有抑制上述基因表达的抑制物或者增强上述基因表达的激活物作为皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子。本发明所涉及的组合物能够预防皮肤斑的形成或除去斑。本发明的医药或皮肤外用组合物，可以以例如水溶液、油液、其它溶液、乳液、霜、凝胶、悬浮液、微嚢、粉末、颗粒、胶嚢、固形剂等形态应用。用历来公知的方法调制成这些形态之后，可以作为洗剂制剂、乳液剂、霜剂、软青剂、硬骨剂、贴剂、气雾剂、水-油2层体系、水-油-粉末3层体系、注射剂、内服剂(锭剂、散剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、糖锭剂等)、栓剂等，对于身体进行涂抹、贴合、喷雾、注射、饮用、插入。去因子，不特别地限定于，基于组合物总量，大概含有例如0.001mM~lM,优选为0.01~lOOmM,更优选为0.110mM左右。在这些剂型中，洗剂制剂、乳液剂、霜剂、软骨剂、硬青剂、贴剂、气雾剂等皮肤外用剂，是适合本发明的目的的剂型。此外，这里所述的皮肤外用剂，包括药物、准药物(软骨剂等)、化妆品[洗面奶、乳液、霜、凝露、精华液(美容液)、面膜等基础化妆品；粉底、口红等彩妆化妆品；口腔化妆品、芳香化妆品、头发化妆品、身体化妆品等l。特别是本发明的医药或皮肤外用组合物适宜作为斑预防的化妆品应用。在本发明的医药或皮肤外用组合物中，根据所期望的剂型，可以适当配合历来公知的赋形剂、香料等，以及油脂类、表面活性剂、防腐剂、金属离子螯合剂、水溶性高分子、增稠剂、颜料等粉末成分、紫外线防御剂、保湿剂、抗氧化剂、pH值调节剂、清洁剂、干燥剂、乳化剂等。还可以在其配合不损害所期望的效果的范围内，在本发明的医药或皮肤外用组合物中配合这些以外的其它药效成分。篩选皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子的方法
技术领域：
：本发明还进一步提供筛逸皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子的方法。该方法的特征在于，评价候补化合物对于抑制上述基因的表达和/或作为其基因产物的上述蛋白质的活性的抑制能力或增强能力，选定具有在适宜的方案中，上述筛选方法进一步包括将上述具有抑制能力或增强能力的抑制物或激活物应用于皮肤模型，选定具有皮肤斑形成抑制和/或皮肤斑除去效果的抑制物或激活物。对于上述抑制物或激活物的皮肤斑形成抑制和/或皮肤斑除去效果进行确认的工序，可以利用皮肤模型，例如皮肤细胞单层培养、共培养、三维培养、斑模型小鼠(特愿2003-343549)，实施这些抑制物或激活物。在适宜的方案中，可以通过在调制这些抑制物或激活物的溶液，例如水溶液后，反复涂抹在皮肤斑模型动物的皮肤上，评价斑的形成，来判定上述效果的有无。以下，列举具体例子更具体地说明本发明。此外，本发明并不受这些限制。实施例老年性色素斑样品老年性色素斑在位于16名知情同意的40岁以上男性志愿者的背部的斑中，根据皮肤科医生的鉴别选定老年性色素斑，在局部麻醉下通过活组织检查采集3mm表皮和真皮上层。采集依照资生堂伦理委员会的指南进行。从皮肤采集RNA将老年性色素斑和作为对照从附近正常部位和臀部采集的皮肤片用液氮冷冻粉碎后，用isogen(日本'-一；/社，按照制造者推荐的方法)提取RNA，用RNeasy(Qiagen公司)纯化。RNA用Bioanalyzer(AgilentTechnologies乂i^司)电泳，确i人品质、纯度。微阵列用样品的反应样品的调制和杂交依照Agilent公司推荐的方法进行。从100~300ng总RNA中，用LowRNAInput卩-7增幅&5《乂W匕《少卜(低RNA输入的线性扩增和标记化试剂盒)(Agilent公司)合成了标记的cRNA。用RNeasy(Qiangen社，按照制造者推荐的方法)纯化后，与WholeHumanGenome才卩7*k4(全人类基因组寡核苷酸阵列)(Agilent公司，G4112A)杂交，清洗，用Agilent公司的扫描仪进行数据读取。分析结果整体地分析了约40000种基因的表达，其结果是在老年性色素斑皮肤中，与9例的臀部非露光部位对照相比，除了黑素细胞相关基因的增强之外，炎症类的基因的增强也是特征性的。该斑/非露光部位的比较与在斑模型小鼠中的分析相对应，结果也是一致的。其次，在与老年性色素斑附近的正常部位的ll例的比较中，在与黑素细胞相关、炎症类基因等各种基因增强的同时，表l、2所示那样的脂质相关基因、信息传递类基因的表达增强，和含有表3所示那样的角质化相关基因的基因群被抑制，都是特征性的。为了研究脂质类增强基因在皮肤的表达分布，进行了原位杂交(图1)。在微阵列分析中增强了的脂质类基因中，所检查的FADS2，ALOX，ZAP128被认为在表皮中表达，且确认了其在斑部位的增强倾向。在表达降低基因中占有大多数的角质层构成蛋白中，通过免疫染色研究在颗粒层表达的纤丝聚集蛋白(Fillagrin)和总苞蛋白(Involucrin)在皮肤内的表达分布(图2)。确认了在斑部位这些蛋白的表达降低倾向。由于从角质层构成蛋白的降低可以预想角质层自身的变化，所以将角质层可视/化，数出其层数(图3)。其结果显示了在斑部位角质层层数较多。这表示角质层剥离的低下。从角质层构成蛋白和角质层剥离的降低，暗示了角质形成细胞的分化的降低。所以，看了一下角质形成细胞的增殖怎样(图4)，结果观察到在斑部位基底层增殖细胞明显较少。这些大部分被认为是基底层的角质形成细胞。即，认为在斑部位发生角质形成细胞的增殖降低、角质层形成和剥离的低下，作为其结果产生了代谢更新的降低。除此之外，还认为在斑部位引起脂质类基因的过度增强，产生了角质形成细胞的分化异常。除了这样的状况之外，认为还有在露光部位特征性的慢性炎症倾向所造成的角质形成细胞的刺激等，产生黑色素的过度生产、代谢更新的降低造成的黑色素滞留，形成了色素沉着。权利要求1.用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法，其特征在于，在编码选自MLSTD1，MOGAT1，FADS2，FADS1，HSD3B1，ELOVL3，BG1，PECR，FABP7，FA2H，HAO2，ALOX15B的蛋白质的基因的表达比正常表皮中的表达增强的情况下，判断为是容易形成斑的皮肤。2.用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法，其特征在于，在编码选自PDE6A，LZTS1，SEC1化4，BAMBI，CIDEA，TERE1，GAL，THRSP，INSIG1，CUTL2的蛋白质的基因的表达比正常表皮中的表达增强的情况下，判断为是容易形成斑的皮肤。3.用于预知皮肤斑形成的皮肤检查方法，其特征在于，在编码选自RBBP6，MSMB，WIF1，ANKRD12,FLG，SYNE2,SCEL，NKTR，AMBP的蛋白质的基因的表达比正常表皮中的表达降低的情况下，判断为是容易形成斑的皮肤。4.如权利要求1~3的任一项所述的方法，该方法通过测定从表皮提取的编码所述蛋白质的mRNA的量，来确定所述表皮中的所述基因的表达的增强。5.筛选皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子的方法，其特征在于，根据抑制权利要求1~2的任一项所规定的基因的表达和/或该基因的蛋白质产物的活性的能力，评价候补化合物，选定具有该抑制能力的抑制物作为皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子。6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括将所述具有抑制能力的抑制物应用于皮肤模型，选定具有皮肤斑形成抑制和/或皮肤斑除去效果的抑制物。7.筛选皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子的方法，其特征在于，根据增强权利要求3所规定的基因的表达和/或该基因的蛋白质产物的活性的能力，评价候补化合物，选定具有该增强能力的激活物作为皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子。8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括将所述具有增强能力的激活物应用于皮肤模型，选定具有皮肤斑形成抑制和/或皮肤斑除去效果的激活物。9.美白方法、斑形成抑制方法或斑除去方法，该方法是通过抑制编码选自MLSTD1，MOGATl，FADS2，FADS1，HSD3B1，ELOVL3，BG1，PECR，FABP7，FA2H，HA02,ALOX15B的蛋白质的基因表达增强的美白方法、斑形成抑制方法或斑除去方法。全文摘要本发明提供用于预知皮肤斑形成的皮肤检验方法。该方法提供特征如下的方法在表皮中的MLSTD1，MOGAT1，FADS2，FADS1，HSD3B1，ELOVL3，BG1，PECR，FABP7，FA2H，HAO2，ALOX15B，PDE6A，LZTS1，SEC14L4，BAMBI，CIDEA，TERE1，GAL，THRSP，INSIG1，CUTL2的表达比正常的表皮中的表达增强的情况下，或者RBBP6，MSMB，WIF1，ANKRD12，FLG，SYNE2，SCEL，NKTR，AMBP降低的情况下，判断为容易形成斑的皮肤。文档编号G01N33/50GK101426934SQ20078001437公开日2009年5月6日申请日期2007年4月24日优先权日2006年4月25日发明者岸本治郎,茂吕修,青木宏文申请人:株式会社资生堂