专利名称：玉米弯孢叶斑病菌突变菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米弯孢叶斑病菌突变菌株的构建方法，具体涉及一种通过限 制性内切酶介导的基因整合化技术获得玉米弯孢叶斑病菌突变株的方法，用于玉米 弯孢叶斑病菌弱致病菌株的筛选。
背景技术：
玉米弯孢叶斑病(C"rw/Jaria Leaf Spot)由新月弯孢霉(0/rn/7arfa (Wakker) Boed)引起，在世界的大部分国家造成过重大危害。1996年，该病在中国 造成严重的玉米损失，40%玉米产区被该病侵染。1998年辽宁省进行病害调查时， 发现了玉米弯孢叶斑病菌白化突变菌株，这些白化菌株致病力较普通黑色菌株弱。 将这些白化株和野生菌株同时在PDA培养基中28。C培养一周，测定菌丝形态和生长 率的变化，发现白色突变株的孢子和菌丝形态都发生变化，菌丝生长率也较野生菌 株低。正因为如此，这些白化菌株可能作为弯孢菌致病性分化的选择标记或诱导抗 性的候选菌株。
传统方法选用抗病品种控制该病害的发生，这不失为有效的控制病害发生的方 法，但却很难实现，因为一种抗病品种的选育往往需要很长的时间，并且国内外很 多研究证明病原菌本身存在致病性分化的现象，给抗病品种的选育带来了困难。另 一方面，已有研究表明当某一抗病品种在同一地区多年大面积种植后，往往就会失 去原来抗病能力，这是致病菌株小种发生变异的结果。目前的研究集中在病原菌的 发生规律、品种资源抗性鉴定、病原流行方面，然而对于该病原菌致病性分化却缺 少深入研究。尽管前期工作通过部分同工酶和DNA多态生分析可以在一定程度上反 映出它们与致病性分化的关系，但DNA多态性本身尚不能完全体现何种功能因子以 何种方式调控病菌的致病性分化。目前创造突变的方法主要以理化诱变法为主，该方法诱变效率低，需要从大量 的菌株中通过单个克隆来筛选突变体，同时要探明影响突变体的营养和形态的变 化，需用图谱等方法克隆突变基因，费工费时。限制性内切酶介导的基因整合化技 术技术的插入突变是在限制性内切酶介导下通过质粒DNA的异源随机插入而使基因 突变，从而直接获得突变株和基因标记。如何将此技术应用于转化玉米弯孢叶斑病 菌，筛选出致病菌减弱的优良突变株，高效分离病菌致病性相关基因，提高真菌的 转化效率，是一项具有重要意义的研究新课题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种玉米弯孢叶斑病菌突变菌株 的构建方法，可以筛选出稳定的玉米弯孢叶斑病菌突变菌株，用于克隆玉米弯孢菌 致病性相关基因。
为实现上述目的，本发明采用限制性内切酶介导的基因整合技术，将提取质粒 DNA与制备的木霉菌原生质体混合，在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒片 段插入染色体组诱导插入突变，培养筛选获得稳定突变菌株。 本发明的方法具体包括以下步骤
1、 取新月弯孢霉菌种在PDA培养基上培养后，配制成孢子悬浮液；将孢子悬 浮液加入到麦芽汁培养液中，孢子悬浮液与麦芽汁培养液的体积比为l一3: 100;
每升麦芽汁培养液含葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，磷酸氢二钾5g，以12Brix 的麦芽汁配制，调节pH6.0;振荡培养，离心收集菌体，再用无菌水冲洗，离心收 集获得新月弯孢霉菌体，利用新月弯孢霉菌体配制成原生质体悬浮液。
2、 取冷冻保存含有质粒的大肠杆菌菌种接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养 基中，培养至对数生长期后置于离心管中，离心，提取质粒DNA。
3、 在离心管中加入质粒DNA 38-42吗、浓度为10个单位/微升的限制性内切 酶〃i/7offll0叱、CaCl2溶液200叱，配制成酶一质粒混合液，然后向离心管中加入 100-200叱原生质体悬浮液，并使其与酶一质粒混合液混匀，置冰上15-20tnin;向
4离心管中加入2mL6(W聚乙二醇，冰浴20-25rain，然后将离心管取出在28卩下放置 10-20min;加入5mL预冷的CaCl2溶液，4'C下离心，弃上清，加入3mL麦芽汁培养 液，3(TC下放置6-7h;将离心管中的混合液倒入培养皿中，然后加入预先熔化好并 冷却至45 —5(TC的再生培养基，使混合液与再生培养基混匀；所述再生培养基每升 含葡萄糖10g、酵母膏5g、 0.6molKCl、琼脂粉10g，以6 Brix麦芽汁配制，调节 pH为6.0;再生培养基冷却凝固后，加入潮霉素浓度为300毫克/毫升的水琼脂培 养基10-12mL;将培养皿在28-3(TC下培养4-5d，将长出的菌落转移到含有250毫 克/毫升潮霉素的固体PDA培养基上进行二次筛选，得到突变体。
4、将二次筛选后得到的突变体转接到不含潮霉素的PDA上，培养长出菌落后， 继续转接到不含潮霉素的PDA上培养，如此重复若干次后，再转接到含潮霉素的PDA 上培养，筛选出稳定突变的菌株，即获得玉米弯孢叶斑病菌突变菌株。
本发明采用限制性内切酶介导的基因整合技术，将提取质粒DNA与制备的木霉 菌原生质体混合，在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒片段插入染色体组诱 导插入突变。获得稳定突变菌株后，可通过菌落颜色筛选出白化菌株，并进一步将 野生菌株和白化菌株同时接种玉米品种，通过调查比较发病情况，记录病情指数， 鉴定出致病性减弱的菌株。
本发明方法构建的玉米弯孢叶斑病菌突变菌株通过利用限制性内切酶介导的 基因整合化技术可以创造广泛的遗传变异，为筛选弱致病性弯孢菌株提供了丰富的 筛选菌源，同时还可用于克隆玉米弯孢菌致病性相关基因，为深入研究玉米弯孢菌 菌株致病机理奠定了基础。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不构成 对本发明的限定。实施例l
1、在PDA培养基上将新月弯孢霉菌种培养7天后，用灭菌钩刮下孢子加入到 无菌水中使其混匀，配制成孢子悬浮液。调整孢子悬浮液的浓度达到lxl(^孢子/ 毫升。取孢子悬浮液lmL加入到100mL的麦芽汁培养液中，每升麦芽汁培养液含 葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，磷酸氢二钾5g，以12Brix的麦芽汁配制， 调节pH6.0。在28'C， 180rpm下，振荡培养过夜后，离心收集菌体，用无菌水冲洗 离心3次，获得新月弯孢霉菌体。
将1.5g新月弯孢霉菌体加入25mlpH7.0缓冲液，再加入5X的DTT，放置摇床 上慢速振荡30min，然后用CaCl2溶液离心洗涤，倒掉上清。加入5ml以pH 5. 6柠 檬酸一磷酸氢二钠缓冲液配制的0.6 mol/L KC1悬浮液，lml悬浮液加入4mlCaCl2 溶液，然后加入终体积为4g/L的崩溃酶，于80。C, 80rpm振荡4h，形成原生质体， 用500目尼龙筛过滤，滤液离心去除酶液，用CaCl2溶液洗漆两次，最后加入5mlCaCl2 溶液制成原生质体悬浮液。
2、取冷冻保存含有质粒的大肠杆菌菌种接到含有100微克/毫升的氨苄青霉素 的50毫升的LB液体培养基中，37。C保温200转/分钟震荡培养12小时至对数生长 期，取已培养至对数生长期的1.5毫升细菌培养液于离心管中，50()0-55()()转/分离 心5分钟。弃上清，向留有沉淀的离心管中加入100微升含有50.0毫摩尔/升葡萄 糖、10.0毫摩尔/升乙二胺四乙酸和25.0毫摩尔/升三羟甲基氨基甲垸的溶液。冰 浴5分钟，再加入200微升含有200毫摩尔/升氢氧化钠、1%十二烷基硫酸钠的溶 液，置冰浴5分钟使质粒DNA变性后，再加入150微升含有3. 0摩尔/升醋酸钠 (pH4.8)混匀，冰浴10分钟。向离心管中加入450微升的酚氯仿异戊醇(体 积比25: 24: 1)的混合物进行抽提，10000转/分离心10分钟，重复此步骤2次。 最后加入10微克/毫升RNase A， 37。C温育30分钟。获取质粒DNA。
3、在50mL离心管中加入质粒DNA 40吗、浓度为10个单位/微升的限制性内 切酶历77dlI10叱、CaCl2溶液200叱，配制成酶一质粒混合液，然后向离心管中加入100叱原生质体悬浮液，并使其与酶一质粒混合液混匀，置冰上20min，缓慢向离 心管中加入2mL 60%聚乙二醇，冰浴20min，然后将离心管取出在28'C下放置10min， 加入5mL预冷的CaCl2溶液，4'C下离心，弃上清，加入3mL麦芽汁培养基。每升麦 芽汁培养基含葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、磷酸氢二钾5g、以12 Brix 麦芽汁汁配制，调节pH为6. 0。 3(TC下放置6h。将离心管中的混合液倒入培养皿中， 然后加入预先熔化好并冷却至5(TC左右的再生培养基，每升再生培养基含葡萄糖 10g、酵母膏5g、 0如1KC1、琼脂粉10g，以6Brix麦芽汁配制，调节pH为6. 0。 尽快使混合液与再生培养基混匀。
再生培养基冷却凝固后，加入潮霉素浓度为300毫克/毫升的水琼脂培养基 lOmL。将培养皿在28。C下培养5d，将长出的菌落转移到预先倒好的含有250毫克/ 毫升潮霉素的固体PDA培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到的木霉菌即为所要 得到的突变体。
4、将二次筛选后得到的突变体转接到不含潮霉素的PDA上，28。C下培养，待 长出菌落后，继续转接到不含潮霉素的PDA上，如此重复7次后，再转接到含有潮 霉素25(^g. mL—1的PDA上培养，筛选出稳定突变的菌株，即获得玉米弯孢叶斑病菌 突变菌株。
本发明获得的稳定突变菌株可用于玉米弯孢叶斑病菌弱致病菌株的筛选。 在获得稳定突变菌株后，将野生菌株和突变菌株同时接种玉米品种，通过调查
比较发病情况，记录病情指数，鉴定出致病性减弱的菌株。野生株病情指数达到68
% ，突变菌株病情指数为33. 4% 。
实施例2
1、在PM培养基上将新月弯孢霉菌种培养6天后，用灭菌钩刮下孢子加入到 无菌水中使其混匀，配制成孢子悬浮液。调整孢子悬浮液的浓度达到1.5xlO 孢子/ 毫升。取孢子悬浮液lmL加入到100mL的麦芽汁培养液中，每升麦芽汁培养液含葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，磷酸氢二钾5g，以12Brix的麦芽汁配制， 调节pH6.0。在28'C， 180rpm下，振荡培养过夜后，离心收集菌体，用无菌水冲洗 离心3次，获得新月弯孢霉菌体。
将lg新月弯孢霉菌体加入25mlpH 7. 0缓冲液，再加入5%的DTT，放置摇床上 慢速振荡30min，然后用CaCl2溶液离心洗涤，倒掉上清。加入5ml以pH 5. 6柠檬 酸一磷酸氢二钠缓冲液配制的0. 6 mol/L KC1悬浮液，lml悬浮液加入4mlCaCl2溶 液，然后加入终体积为4g/L的崩溃酶，于8(TC， 80rpm振荡4h，形成原生质体，用 500目尼龙筛过滤，滤液离心去除酶液，用CaCl2溶液洗涤两次，最后加入5mlCaCl2 溶液制成原生质体悬浮液。
2、 取冷冻保存含有质粒的大肠杆菌菌种接到含有100微克/毫升的氨苄青霉素 的50毫升的LB液体培养基中，37'C保温140转/分钟震荡培养16小时至对数生长 期，取已培养至对数生长期的2毫升细菌培养液于离心管中，5000-5500转/分离心 5分钟。弃上清，向留有沉淀的离心管中加入100微升含有50.0毫摩尔/升葡萄糖、 10. 0毫摩尔/升乙二胺四乙酸和25. 0毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷的溶液。冰浴10 分钟，再加入200微升含有210毫摩尔/升氢氧化钠、1%十二烷基硫酸钠的溶液， 置冰浴5分钟使质粒DNA变性后，再加入150微升含有4. 0摩尔/升醋酸钠(pH4. 8)
混匀，冰浴5分钟。向离心管中加入450微升的酚氯仿异戊醇(体积比25: 24:
1)的混合物进行抽提，15000转/分离心10分钟，重复此步骤3次。最后加入20 微克/毫升RNase A， 37。C温育60分钟。获取质粒DNA。
3、 在50mL离心管中加入质粒DNA 42昭、浓度为10个单位/微升的限制性内 切酶〃i/7dlI10叱、CaCl2溶液200叱，配制成酶一质粒混合液，然后向离心管中加入 IOO叱原生质体悬浮液，并使其与酶一质粒混合液混匀，置冰上15min，缓慢向离 心管中加入2mL 60%聚乙二醇，冰浴25min，然后将离心管取出在28'C下放置20min， 加入5mL预冷的CaCl2溶液，4'C下离心，弃上清，加入3mL麦芽汁培养基。每升麦 芽汁培养基含葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、磷酸氢二钾5g、以12 Brix麦芽汁汁配制，调节pH为6. 0。 30'C下放置6h。将离心管中的混合液倒入培养皿中， 然后加入预先熔化好并冷却至45'C左右的再生培养基，每升再生培养基含葡萄糖 10g、酵母膏5g、 0.6molKCl、琼脂粉10g，以6Brix麦芽汁配制，调节pH为6. 0。 尽快使混合液与再生培养基混匀。
再生培养基冷却凝固后，加入潮霉素浓度为300毫克/毫升的水琼脂培养基 12mL。将培养皿在3(TC下培养4d，将长出的菌落转移到预先倒好的含有250毫克/ 毫升潮霉素的固体PDA培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到的木霉菌即为所要 得到的突变体。
4、将二次筛选后得到的突变体转接到不含潮霉素的PDA上，28'C下培养，待长 出菌落后，继续转接到不含潮霉素的PDA上，如此重复7次后，再转接到含有潮霉 素250PgmL—t的PDA上培养，筛选出稳定突变的菌株，即获得玉米弯孢叶斑病菌突变 菌株。
在获得稳定突变菌株后，将野生菌株和突变菌株同时接种玉米品种，通过调查 比较发病情况，记录病情指数，鉴定出致病性减弱的菌株。野生株病情指数达到70 %，突变菌株病情指数为30%。
权利要求
1、一种玉米弯孢叶斑病菌突变菌株的构建方法，其特征在于包括如下具体步骤1)取新月弯孢霉菌种在PDA培养基上培养后，配制成孢子悬浮液；将孢子悬浮液加入到麦芽汁培养液中，孢子悬浮液与麦芽汁培养液的体积比为1-3∶100；每升麦芽汁培养液含葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，磷酸氢二钾5g，以12Brix的麦芽汁配制，调节pH6.0；振荡培养，离心收集菌体，再用无菌水冲洗，离心收集获得新月弯孢霉菌体，利用新月弯孢霉菌体配制成原生质体悬浮液；2)取冷冻保存含有质粒的大肠杆菌菌种接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至对数生长期后置于离心管中，离心，提取质粒DNA；3)在离心管中加入质粒DNA 38-42μg、浓度为10个单位/微升的限制性内切酶HindIII10μL、CaCl2溶液200μL，配制成酶-质粒混合液，然后向离心管中加入100-200μL原生质体悬浮液，并使其与酶-质粒混合液混匀，置冰上15-20min；向离心管中加入2mL 60％聚乙二醇，冰浴20-25min，然后将离心管取出在28℃下放置10-20min；加入5mL预冷的CaCl2溶液，4℃下离心，弃上清，加入3mL麦芽汁培养液，30℃下放置6-7h；将离心管中的混合液倒入培养皿中，然后加入预先熔化好并冷却至45-50℃的再生培养基，使混合液与再生培养基混匀；所述再生培养基每升含葡萄糖10g、酵母膏5g、0.6mol KCl、琼脂粉10g，以6Brix麦芽汁配制，调节pH为6.0；再生培养基冷却凝固后，加入潮霉素浓度为300毫克/毫升的水琼脂培养基10-12mL；将培养皿在28-30℃下培养4-5d，将长出的菌落转移到含有250毫克/毫升潮霉素的固体PDA培养基上进行二次筛选，得到突变体；4)将二次筛选后得到的突变体转接到不含潮霉素的PDA上，培养长出菌落后，继续转接到不含潮霉素的PDA上培养，如此重复若干次后，再转接到含潮霉素的PDA上培养，筛选出稳定突变的菌株，即获得玉米弯孢叶斑病菌突变菌株。
全文摘要
本发明涉及一种玉米弯孢叶斑病菌突变菌株的构建方法，取新月弯孢霉菌种扩大培养后配制成原生质体悬浮液，取冷冻保存含有质粒的大肠杆菌菌种接种培养后提取质粒DNA，并配制酶-质粒混合液，将原生质体悬浮液与酶-质粒混合液混匀，培养筛选得到突变体后再经不含潮霉素和含潮霉素的PDA上培养，筛选获得稳定的玉米弯孢叶斑病菌突变菌株。本发明采用限制性内切酶介导的基因整合技术，将质粒DNA与制备的木霉菌原生质体混合，并在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒片段插入染色体组诱导插入突变。获得的突变株为筛选弱致病性弯孢菌株提供了丰富的筛选菌源，可用于克隆玉米弯孢菌致病性相关基因及研究玉米弯孢菌菌株致病机理。
文档编号C12R1/645GK101328465SQ200810041218
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月31日 优先权日2008年7月31日
发明者刘力行, 翟羽红, 捷 陈 申请人:上海交通大学