鲬和李氏*的快速鉴别试剂盒及鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明属渔业资源调查鱼类的鉴别技术领域，尤其涉及鯆和李氏飾快速鉴别方 法。
[0002]背景介绍
[0003] 鯆是我国的重要经济鱼种之一，在中国渔业经济中占有重要地位。鯆属軸形目鯆 科，为近海底层鱼类，成体体长一般为200~350mm，其幼鱼在外形上与鲈形目雛?科的李氏 飾十分相似。这两种鱼分类地位不同，成鱼形态差异明显，幼鱼却因形态相似不易分辨。实 际的海洋渔业资源拖网调查中往往能同时捕获大量的鯆幼体和李氏鱅成体，其体长多在80 ~120mm之间，根据传统的分类方法不易区分二者，导致渔业资源信息统计错误，甚至 Genbank中亦有将李氏麟，序列误作为鯆序列公布的情况，这对于渔业资源的有效利用、可 持续发展和系统研究产生负面影响，尤其是对于作为重要经济种类的鯆资源管理利用和相 关研究十分不利。
[0004] 目前，鯆和李氏f銜的分类通常使用两类方法:形态学方法及基因序列法。常规的形 态学分类主要通过以下两点区分鯆和李氏銷：
[0005] 1)第一背鳍:鯆第一背鳍与第二背鳍紧邻，背鳍鳍式为I，VIII;李氏鋪第一背鳍与 第二背鳍分开，背鳍鳍式为IV;
[0006] 2)棘或小刺:鯆的前鳃盖骨后下角有2棘，李氏鑛丨前鳃盖骨棘末端上缘有3小刺。
[0007] 如果渔获物形态完整，通过仔细分辨第一背鳍、棘或小刺可区分体长相仿的鯆幼 鱼和李氏雌?。由于拖网、保存和运输过程中的外力破坏，经常出现一部分形态特征受损甚 至个体残缺的不完整渔获样品，无法从形态特征对其种类进行鉴别。近年来许多外形相似 的渔获种类都利用基因序列进行鉴别分类，该方法主要是对受检对象线粒体中的C0I片段 进行扩增、测序，利用DNA中碱基序列的特异性进行物种区分鉴别，该方法虽然准确，但耗时 长、花费高，需动用大型实验设备。因此，开发一种快速、准确、成本低廉的方法来鉴别鯆幼 鱼与李氏是很有必要的。
【发明内容】
[0008] 为了克服形态分类鉴定方法的不准确性以及基因序列分类耗时长、花费高等不 足，本发明旨在建立一种稳定性高、快速准确、成本低廉的方法对鯆和李氏?进行区分鉴 别。
[0009] 为实现上述目的，本发明首先提供一种鯆和李氏鑛的快速鉴别试剂盒，该试剂盒 中包括碱基序列为SEQ ID No. 1/2的引物对，以及限制性内切酶Hinfl或其同切酶。
[0010]序列为SEQ ID No. 1 的正向引物：F 5'_caaccacaaagacattggcacyctc_3'；
[0011 ]序列为SEQ ID Νο·2的反向引物：R 5'_tagacttctgggtggccaaaga_3'。
[0012] 其中所述的限制性内切酶Hinfl或其同切酶的酶切位点为5'···6νΑ Ν ΤΟ··3'的限 制性内切酶。
[0013] 另一方面，本发明提供一种鯆和李氏麵的快速鉴别方法，包括对样品总DNA进行 PCR扩增的步骤，所述PCR扩增引物对的碱基序列为SEQ ID Νο.1/2:
[0014] 序列为SEQ ID No. 1 的正向引物：F 5'_caaccacaaagacattggcacyctc_3'；
[0015] 序列为SEQ ID Νο·2的反向引物：R 5'_tagacttctgggtggccaaaga_3'。
[0016] 进一步地，本发明所述的鯆和李氏爾餘的快速鉴别方法中还包括对PCR产物酶切的 步骤，所述的酶切步骤使用限制性内切酶Hinfl或其同切酶。这些限制性内切酶的酶切位点 为5'…GVA N TC…3'的限制性内切酶。
[0017] 本发明在扩增受检个体C0I片段的基础上，采用限制性内切酶酶切的方法，使不同 物种产生特异性酶切图谱，根据图谱中条带的大小判断受检个体的分类归属，避免了扩增 后的测序过程，建立了针对鯆/李氏鑛的稳定性高、快速准确、成本低廉的鉴别方法，其有 益效果具体包括：
[0018] 1.不受形态特征影响：能够针对形态特征不明显或外力造成形体损伤等无法利用 传统形态法分类的个体进行鉴定。
[0019] 2.不受个体发育阶段限制:排除了时空限制、遗传因素等造成的表型差异，从DNA 分子水平上提供可靠的分类依据。
[0020] 3.准确快速、成本低廉:与传统形态分类法相比，利用DNA分子手段鉴定更为科学、 准确；与常规的DNA检测技术相比，直接对PCR产物进行酶切40min即可电泳检测得出结果， 无需测序，节省时间且降低成本。
【附图说明】
[0021]本发明附图1幅：
[0022] 鯆及李氏臟聚合酶链式反应-酶切分型琼脂糖凝胶电泳图谱，图中：
[0023] M：DL 2000DNA Marker；
[0024] D1、D2:试剂盒法提取的李氏鎌DNA;
[0025] D3、D4:试剂盒法提取的鯆DNA;
[0026] P1、P2:李氏鱗PCR扩增产物；
[0027] 卩3、？4:鯆卩〇財广增产物；
[0028] HI、H2:李氏鑛PCR扩增后Hinfl酶切产物；
[0029] H3、H4:鯆PCR扩增后Hinfl酶切产物。
【具体实施方式】
[0030]本发明是在PCR扩增受检样品CO I片段的基础上，采用限制性内切酶对PCR产物进 行酶切的方法，使不同物种来源的待测样品产生特异性的酶切图谱，并可根据图谱中条带 的大小判断待测样品的分类来源。
[0031] 本发明首先提供一种鯆和李氏鎌j的快速鉴别试剂盒，该试剂盒中包括碱基序列为 SEQ ID No.1/2的引物对，以及限制性内切酶Hinfl或其同切酶。该所述的试剂盒，可以用于 下述本发明的鯆和李氏雜?的快速鉴别方法的任意【具体实施方式】。所述的鉴别方法，基本地 包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，所述PCR扩增引物对的碱基序列为SEQ ID No. 1/2:
[0032] 序列为SEQ ID No · 1 的正向引物：F 5'-caaccacaaagacattggcacyctc-3'；
[0033] 序列为SEQ ID Νο·2的反向引物：R 5'_tagacttctgggtggccaaaga_3'。
[0034] 进一步地，本发明所述的鯆和李氏麵的快速鉴别方法中还包括对上述PCR产物酶 切的步骤，所述的酶切步骤使用限制性内切酶Hinfl或其同切酶。这些限制性内切酶的酶切 位点为5'…GVA Ν ΤΟ··3'的限制性内切酶。
[0035] 更为具体地，本发明的鯆和李氏鑛的快速鉴别方法包括如下步骤：
[0036] a.提取样品总DNA;
[0037] b.PCR扩增：以步骤a所提取的样品总DNA为模板，使用引物SEQ ID如.1/2进行卩0? 扩增；
[0038] c.使用限制性内切酶Hinfl或其同切酶对步骤b所得PCR扩增产物进行酶切；
[0039] d.对步骤c所得酶切产物进行电泳检测；
[0040] e.结果判定。
[0041] 本发明的方法中，首先提取待检测样品的总DNA，【具体实施方式】中