，步骤a优选使用 海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行。然后本发明利用一对引物SEQ ID No. 1/2,通过 PCR的方法扩增⑶I基因的一段DNA片段，并继而以限制性内切酶Hinfl或其同切酶对PCR产 物进行酶切，以得到特异性的酶切图谱。
[0042]所述的PCR扩增可采用本领域常规体系，优选的PCR的扩增参数包括94°C预变性 2min; 94°C30s，58°C30s，72°Clmin，30个循环;72°C延伸lOmin。扩增后于相同条件下的凝胶 电泳检测，不能完全区分鯆/李氏雜?:样品。其中所述及的凝胶电泳检测，在本发明中优选采 用的体系为：〇 . 5 X ΤΒΕ缓冲液，1.5 %的琼脂糖凝胶电泳，恒压120V、电流50mA，电泳30~ 35min〇
[0043] 所述的PCR产物以限制性内切酶Hinfl或其同切酶进行酶切是产生特异性具有检 测意义的产物片段的关键步骤。所述的酶切体系可采用本领域常规体系，优选的酶切体系 内添加的PCR产物终浓度不超过50ngAiL，Hinf I内切酶终浓度为0.5U/yL，酶切反应液在PCR 仪中37°C保温40min。
[0044] 鯆PCR产物经酶切后被消化为279bp、399bp和24bp的片段，其中24bp因片段因过短 导致电泳后不可见，即鯆酶切图谱为399bp和279bp两条清晰条带；李氏纖的PCR产物经酶 切后可被消化为79bp、200bp、399bp和24bp的片段，79bp和24bp片段过短导致电泳后不可 见，即李氏衡f酶切图谱为399bp和200bp两条清晰条带。显然，经酶切处理后，来源于鯆或李 氏爾f的供试样品的电泳行为有明显差异，根据电泳图谱所显示的DNA片段大小，可准确鉴 别其种类，采用的判断标准可简述为：
[0045] a.凝胶电泳结果包含399bp和279bp条带，则供试样品来自鯆；
[0046] b.凝胶电泳结果包含399bp和200bp条带，则供试样品来自李氏鑛。
[0047] 下述非限制性实施例用于进一步说明本
【发明内容】
，不应当理解为对本发明任意形 式的限定。如无特殊说明，本发明所使用的鯆和李氏雜?样品捕捞自辽东湾，每个样品设2个 平行。
[0048] a.DNA的提取:取待测样品，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提 取样品总DNA，完成DNA提取后通过Nanodrop微量分光光度计测定浓度，用去离子水将其浓 度调至100~200ng/yL备用
[0049] b.PCR 反应：
[0050] bl:反应体系50yL，包括：
[0052] b2:PCR 反应：
[0053]反应在PCR仪上运行，具体条件为：
[0054] 94°C，2min;
[0055] 94°C，30s; 58°C，30s; 72°C，lmin，30个循环；
[0056] 72°C，10min。
[0057] 反应结束后PCR产物置于4°C保存。
[0058] b3:电泳检测：取步骤a制备的样品总DNA、步骤b所制备的PCR产物各2yL，混合6 X Loading Buffer上样缓冲液，以0.5 X TBE为缓冲液，用浓度为1.5 %的琼脂糖凝胶在恒压 120V、电流50mA条件下电泳35min。结果见图1，在全自动凝胶成像仪中可观测到各样品DNA 完整且能扩增出特异性好的单一条带。
[0059] c.酶切反应：
[0060]以2〇yL反应体系，具体如下：
[0063] 将反应液置于?0?仪中37°(3保温4〇11^11后取出，各添加2以以反应液体积的1/10)10 XLoading Buffer停止反应。
[0064] d.电泳检测：
[0065] 以0.5 X TBE为缓冲液，用浓度为1.5 %的琼脂糖凝胶在恒压120V、电流50mA条件下 电泳35min对酶切产物进行检测。
[0066] e.图型比对，鉴定供试样品种类：
[0067] 在全自动凝胶成像仪中对电泳结果进行观测、拍照和分析，结果如附图1所示:鯆 为399bp和279bp两条清晰条带，李氏谢|为399bp和200bp两条清晰条带，完全可区分。据此可 准确鉴别供试样品的种类。
[0068]
【主权项】
1. 鯆和李氏雜?的快速鉴别试剂盒，其特征在于包括碱基序列为SEQIDN0.l/2的引物 对，以及限制性内切酶Hinf I或其同切酶。2. 鯆和李氏雜?的快速鉴别方法，包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，其特征在于， PCR扩增引物对的碱基序列为SEQ ID No. 1/2。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括PCR产物酶切的步骤，所述的酶切步 骤使用限制性内切酶HinfI或其同切酶。4. 根据权利要求3所述的方法，包括如下步骤： a. 提取样品总DNA; b. PCR扩增：以步骤a所提取的样品总DNA为模板，使用引物SEQ ID No. 1/2进行PCR扩 增； c. 使用限制性内切酶HinfI或其同切酶对步骤b所得PCR扩增产物进行酶切； d. 对步骤c所得酶切产物进行电泳检测； e. 结果判定。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤a使用海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒提取待测样品总DNA。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b所述的PCR扩增包括如下参数： 94°C预变性2min; 94°C30s，58°C30s，72°Clmin，30 个循环； 72°C 延伸 IOmin。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤c中酶切反应体系内的PCR产物 终浓度不超过50ngAiL，内切酶终浓度0.5U/yL，反应液于37°C保温40min。8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤d中，电泳检测条件参数包括： 0.5 X TBE缓冲液，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，恒压120V、电流50mA，电泳30~35min。9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤e结果判定是根据下述标准判 定样品来源： a. 凝胶电泳结果包含399bp和279bp条带，则供试样品来自鯆； b. 凝胶电泳结果包含399bp和200bp条带，则供试样品来自李氏麟?。
【专利摘要】鲬和李氏的快速鉴别试剂盒及鉴别方法，所述试剂盒包括碱基序列为SEQ？ID？No.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。本发明提供了一种基于PCR反应-限制性酶切分型的试剂盒产品，并提供基于此的鲬/李氏快速鉴别方法，在扩增受检个体COI片段的基础上，采用限制性内切酶酶切的方法，使不同物种产生特异性酶切图谱，根据图谱中条带的大小判断受检个体的分类归属，避免了扩增后的测序过程，是针对鲬/李氏的稳定性高、快速准确、成本低廉的鉴别方法。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105525020
【申请号】CN201610072848
【发明人】鲍相渤, 刘卫东, 王彬, 赫崇波, 刘修泽, 苏浩, 李玉龙
【申请人】辽宁省海洋水产科学研究院
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月1日