检测杂合性brca1/2基因缺失的方法及所用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于二代测序检测基因缺失突变的 方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是目前全世界范围内发病率快速增长的癌症。WHO发布的乳腺癌世界地理 图谱中，每10万人口发病数为:澳大利亚(83/10万）、美国、加拿大(82/10万）、欧洲（70/10 万）。其次为南美国家(65/10万）、东欧(49/10万）、北非、南非、日本、以色列和阿拉伯均为 (28/10万），而中非、亚洲发病率最低（16-19/10万）。
[0003] 乳腺癌在女性癌症中发病率占第一位，在所有的女性癌症中占1/4以上，欧美人每 7-9位女性一生中要有一位发生乳腺癌。携带有乳腺癌BRCA1致病基因的女性，70岁时患乳 腺癌的机率高达80%以上；美国病理与遗传学会就明确建议每个女性都应检测BRCA1/2基 因。
[0004] 乳腺癌BRCA1基因定位于人类染色体17q21，共有24个外显子(其中有22个编码外 显子），实际长达81kb的染色体区间。其中第10个显子特别长，达3.4kb，BRCAl编码的全部 1863个氨基酸中，第10外显子编码了61 %的氨基酸，所以对外显子10的研究文献众多。关于 BRCA1基因突变BRCA1突变主要位于第10外显子，占全基因突变率2/3，它分为ABCD4个区，生 物学上共分框移(插入），框移(缺失），错义、无义、剪切、多态，未分类，同义等9种突变亚型， 医学上将其聚类为三种医学意义的突变类型，第一类为有害突变，以框移，剪切为主;第二 类为可疑致病突变，它们占了突变率的大多数，表现为错义突变，无义突变，内含子大碱基 (3bp)变化，还有部分单氨基酸缺失的突变。第三类为大量的未明意义的突变，以同义、多态 和非编码突变、沉默突变为主，以及距外显子40bp左右的内含子突变。
[0005] 乳腺癌BRCA2基因位于13号.染色体长臂12-13区，mRNA长约llkb，编码区10987bp， 共有27个外显子，其中第10和第11号外显子特别长，分别为lkb和5kb。
[0006] 如果BRCA1/2基因的结构发生了某些改变，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能 就会受影响。2013年已发现的BRCA1/2的突变有数百种之多。BRCA1及BRCA2是最重要的两个 乳腺肿瘤抑制基因。在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面 有重要作用。如果BRCA1和/或BRCA2发生了突变，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会 受影响，拥有这个基因的家族则具有高乳腺癌发生率的倾向.研究显示有BRCA1基因突变 者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50 % -85 %和15 % -45 %，有BRCA2基因突变者，患乳腺 癌和卵巢癌的风险分别是50 %-85 %和10 %-20 %。除此之外，也更易患其它癌症，如前列腺 癌（男性）、胰脏癌和大肠癌。通过对BRCA1 /2的检测，可以反映出乳腺癌的发生发展，也可对 乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群进行有效的筛检，利于该类疾病的早期发 现以便及早干预、诊断以及治疗。BRCA1/2基因为显性遗传，只要发生杂合型的突变，就会导 致乳腺癌的发生，因此，做基因检测时，需要对杂合性的缺失也进行检测。而传统的高通量 测序，由于在文库构建时，需要用到PCR扩增，就会导致严重或者微小的扩增偏倚，导致难以 准确检测杂合性缺失。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用二代测序技术，针对BRCA1/2基因进行 检测，并且能对杂合型的BRCA1/2基因大片段缺失进行检测；从而找到BRCA1/2疾病的高危 人群。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
[0009] 对BRCA1/2基因的编码蛋白的外显子区域设计产物为370-400bp的特异性引物，每 对特异性引物至少有20bp的重叠区，在特异性引物的5'端，设计一段通用序列(uniseq)以 及5个连续的N碱基，称为标签，这样正向和反向各有5个随机的碱基N，总共10个N;uniseqF 通用序列为：CTACACGACGCTCTTCCGATCT; un i se qR 通用序列为 GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC。 所有序列都进行锁核酸修饰，引物在life公司（原英俊公司）合成，结构中β-D-呋喃核糖的 2 ' -0、4 ' -C位通过缩水作用形成刚性结构，从而实现锁核酸修饰;序列如表1所示：
[0010] 表UBRCA1/2基因的共49个外显子的引物序列
[0016] 备注说明：uniseqF/uniseqR是用于二代测序，是测序引物结合区，正反向各5个 NNNNN才是标签，因此本发明的标签是10个碱基。N在分子生物学中是代表A、G、C、T中的任意 一个碱基，所以5个NNNNN的排列组合就是4的5次方，10个N，就有4的10次方的组合。
[0017] 本发明的具体使用方法如下：
[0018] 1.将以上的特异性引物与基因组DNA进行扩增，设置两个PCR循环;将5个N和通用 弓丨物序列引入至IjDNA链中；体系和条件如下：
[0020]备注说明：上述引物混合液包含表1中的所有引物，每对引物的浓度均为10pM。
[0021 ]将PCR反应管放于PCR仪上，运行下表所示程序：
[0023] 2.按照Beckman的纯化磁珠的标准纯化步骤进行纯化，除去多余的PCR引物，然后 利用两端的通用引物进行PCR扩增，条件如下：
[0025] 引物F:
[0026] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCTACACGACGCTCTTCCGATCTo
[0027] 下划线部分正好与uniseqF-样，用于第二轮的扩增;同时引入一个测序接头。
[0028] 引物R:
[0029] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC〇
[0030]下划线部分正好与uniseqR-样，用于第二轮的扩增；同时引入一个测序接头。
[0031 ] 将PCR反应管放于PCR仪上，运行下表所示程序：
[0033] 进行高通量测序，测序数据与BRCA1/2参考序列（BRCA2:http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000059.3,BRCAl：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/NM_007294.3)比对，对于比对上的序列统计正反向总共10个N碱基的序列，对具有 相同标签(即10个碱基序列完全相同的）的序列视为一条，最后统计序列数。
[0034] 本发明的原理如图1所示。
[0035] 最终统计某外显子的标签数，通过该标签数来反应原始模板量。
[0036] 3、结果判断规则，将未知样本的相对标签数(相对标签数=该外显子标签数/平均 标签数)与阴性样本（即，已知没有BRCA1/2突变，无乳腺癌的健康人样本)的相对标签数进 行比较，并判断:等于0的，为纯合型缺失，大于0且低于H/2的为杂合型缺失，高于1/2低 于)0.8的为疑似杂合型缺失，不容易判断，需要进一步验证。大于0.8的为正常。
[0037]本发明的关键优势：
[0038] 对于人类基因组DNA，100ng的量约含15000个拷贝，而某个基因，在正常人中都会 有两个拷贝，分别一个来自父方，一个来自母方，而当某些病变情况下，其中一方的发生了 缺失或重复，就会导致拷贝数发生变化，杂合型缺失情况下就会变成7500个拷贝，杂合型重 复的情况下就会变成22500个拷贝。而传统的二代测序都是基于PCR扩增，而PCR扩增是非线 性的，20几个循环的扩增将会破坏线性关系，导致终产物的拷贝数没有差别。而传统二代测 序的分析也只统计终产物的测序深度，因此，就不能对杂合型缺失进行判断。
[0039] 而本发明最重要的一点是引物标签技术，正反向引物各加5个N碱基，就能产生4的 10次方的标签数量，约100万种标签。利用这100万不同的标签去结合15000个拷贝的模板， 通过概率计算，2个模板具有相同标签的概率为1万亿分之一，并且后续PCR扩增，只是将相 同的标签扩增出，不会引入新的标签，因此标签的总数量，与模板的拷贝数相关，并且在一 开始时就确定了，不会随着PCR循环数的变化而变化。模板的拷贝数越多，检测到的标签数 量就会越多。同时本发明还包括一系列的数据比对与标签归一化处理等技术，从而能对杂 合型缺失进彳丁精确检测。
[0040] 本发明中所用到的试剂的货号及供应商：
[0041] 1.引物:上海英潍捷基(现被thermo fisher收购)贸易有限公司；
[0042] 2.血液DNA提取试剂盒:Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒(德国快而精公