建立dpls-bs-uve快速鉴别蜂蜜真假的模型方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及建立DPLS-BS-UVE快速鉴别蜂蜜真假的模型方法，属于食品安全领域。 [0002]
【背景技术】
[0003] 蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造 而成的天然甜物质，是一种营养丰富的天然滋养食物。其主要成分为糖类，其中60%_80%是 人体易吸收的葡萄糖和果糖。此外，含有与人体血清浓度相近的多种无机盐和维生素、多种 有机酸及有益人体健康的微量元素和多种氨基酸，以及含有生物活性很强的蔗糖转化酶和 淀粉酶等，具有极高的保健作用和营养价值，深受消费者的喜爱。我国蜂蜜国家标准规定， 不得在蜂蜜中添加或混入任何淀粉类、糖类或代糖类物质。近年来，国内和国际市场对蜂蜜 的需求量不断扩大，然而蜂蜜的产量难以满足市场的需求，且由于蜜源的不同，蜂蜜的种类 繁多，成分复杂，使得蜂蜜品质的检测技术存在很大局限。在巨大经济利益的驱使下，很多 不法分子在高品质蜂蜜中加入其它低品质的蜂蜜以次充好，或者在蜂蜜中掺入果葡糖浆等 甜味物质以假乱真，极大的损害了蜂农，消费者和正规蜂蜜生产企业的利益，严重影响了蜂 蜜产品的市场秩序和我国蜂蜜产品的出口贸易。蜂蜜品质检测技术遇到了很大的挑战。这 些都给不法分子提供了蜂蜜掺假的可乘之机。
[0004] 目前现有的鉴别技术均采用对蜂蜜中某一种或某一类物质进行分析。但是造假者 是根据国家标准的技术指标要求进行调配的，制成的掺假蜂蜜各项理化检测指标完全符合 国家标准，因此采用现有的鉴别技术很难将其与真正的蜂蜜区分开来。
[0005] 自举法(Bootstrap，BS)是一种重采样方法并适合于化学计量学的分析。该方法 可产生η个样本数，且一个较大的重采样次数能够确保数据结构实现很好的模拟。无信息变 量消除法(UVE)是一种基于偏最小二乘相关分析的变量筛选方法，可用于提取对模型无意 义的变量(DPLS-UVE)。
[0006] 然而将自举法与无信息变量消除法结合用于鉴别掺假蜂蜜的鉴定未见报道。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是解决目前以蜂蜜中某一种或某一类物质进行分析从而鉴别掺假 蜂蜜的弊端，将自举法与无信息变量消除法结合，从而可以快速准确的鉴别掺假蜂蜜。
[0009] 首先，本发明建立DPLS-BS-UVE快速鉴别蜂蜜真假的模型方法，包括以下步骤： (1) 收集总数不小于100的样本，其中包括蜂蜜样本、糖浆样本和已知混合比的掺有糖 浆的蜂蜜样本； (2) 利用核磁共振波谱仪对样本进行分析，得到各自的核磁代谢指纹图谱； (3) 将得到的核磁代谢指纹图谱转换形成典型二维矩阵，其中列代表分析样本的种类， 行代表对应分析样本在某一化学位移区间内的峰面积； (4) 将步骤(3)得到的二维矩阵进行数据处理以消除含量差异导致的数据掩盖，并将强 烈界外的观察变量剔除后，采用DPLS-BS-UVE分析;筛选蜂蜜掺假的标志物，并以标志物对 应的谱峰峰面积为X变量，样品类型为Y变量，数值为"0"，代表纯蜂蜜样品，数值为"Γ，代表 糖浆掺假蜂蜜样品，阈值设为0.5 ;将标志物对应的数据矩阵X与类别变量Y进行线性回 归，得到多元线性回归方程， Υ=-0 · 06290Xi-0 · 07438X2+0 · 08985X3-0 · 09160X4-0 · 07896X5+0 · 07828X6+0 · 8595; 其中Υ表示真蜂蜜或假蜂蜜，乂1上、乂3上^和乂6分别表示分段积分后第130、152、397、 419、457和463个谱峰的峰面积； (5) 利用步骤(4)得到的多元线性回归方程对未知样品进行预测，若Υ值接近1±0.5,则 鉴定为真蜂蜜，若Υ值接近〇 ± 〇. 5，则鉴定为假蜂蜜。
[0010] 为了保证所建立方法的可靠性和代表性，我们收集了尽可能多的包括所有的蜜种 和产地的蜂蜜、以及尽可能多种类的糖浆。收集市场上销售的经实验室掺假指标检验合格 的蜂蜜和实验室检测不合格的掺假蜂蜜，以及企业提供的蜂蜜和糖浆样品，其中蜂蜜样品 包括成熟蜜和非成熟蜜，蜜种涉及到杨槐蜜、油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜、紫云英蜜、荔枝蜜、龙 眼蜜、枣花蜜、枸杞蜜、葵花蜜、黄芪蜜、益母草蜜、枇杷蜜、党参蜜、小茴香蜜和杂花蜜;蜂蜜 的加工工艺包括脱水、脱色、脱抗生素；蜂蜜样品涉及的产地包括:江苏、河南、新疆、四川、 内蒙、湖北、辽宁、吉林、陕西、山东、甘肃;糖浆样品包括甜菜糖浆、大米糖浆、木薯糖浆、小 麦糖浆、果葡糖浆或其混合糖浆。
[0011] 在进行核磁共振波谱仪对样本进行分析前需要对样品进行前处理，具体包括以下 步骤： ^对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀，对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超 过60°C的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温； HI将融化后的蜂蜜样品，经0. l〇mm-〇. 14mm孔径尼龙滤布过滤，除去蜂蜜中固体杂质 后，准确称取0.25 g样品于离心管中，加入lmL重水，溶解完全； 圍向步骤③中的溶液中，加入200μ1浓度为1.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH=4.0)和 100μΙ含体积分数为〇 . 05%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液，涡旋振荡至均匀混 合，离心，取上清液于核磁管中； ?Ι调整好核磁波谱仪并把核磁管放置于测定仪中，旋转核磁管以备NMR检测。
[0012] 为了进一步的优选，我们公开前述方法的步骤(2)中样本的核磁共振波谱分析条 件为:测定温度(探头温度）：室温25 °C;环境湿度：35%;观察频率400 MHz;脉冲程序为： Jresgpprqf;谱宽：6410 Hz; 90° 脉冲宽度：pl= 6. 45ys;脉冲延迟时间：dl= 15 s;采 集时间：4 s;累加次数：240。
[0013] 基于优选的核磁共振波谱分析条件，我们进一步公开在方法的步骤(4)中数据处 理采用Mestrenova软件将获得的原始代谢指纹图谱进行峰对齐、基线矫正和相位矫正。
[0014] 结合前述的波谱分析条件，我们将3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠做内标物，化学 位移设为〇.〇〇进行谱峰对齐;基线校正选择polynomial fit拟合方式;相校正选择global 和metabonomics算法先自动优化，后针对特定区域进行手动校正，使尽可能多的积分值为 正值。
[0015] 然后将咕化学位移δ为4.69~5.20区间的谱峰强度置为零，并从数据矩阵中 剔除，同时将内标的化学位移S0.〇〇-〇. 10之间的谱峰也从数据矩阵中剔除。
[0016] DPLS-BS方法是一种经典的重采样方法，通过对原始数据的采样获得更多的数据。 不需要进行先验性的假设，并已经用于PLS分析的变量筛选研究中。该方法首先需要建立 DPLS模型，基于所有bootstrap样品可估计其回归系数的置信区间。最后，通过将PLS回归系 数的置信区间不包含"〇"的部分作为生物标记物。
[0017] 因为不对任何已知的参数分布作出假设，因此非参数的bootstrap方法可用于估 计相关系数的均值(）和置信区间(D)。在某显著性水平下，如果置信区间包含"0"，那么相关 性不显著并作为奇异值剔除。/D值越大表明相关性越显著，将其按照大小值降序排列，排列 越前贡献率越大，可作为生物标记物。
[0018] DPLS-UVE方法:数据集中X和y变量的线性关系可表达为：，Χ (η X p)代表了样本 数，y (η X 1)代表了变量响应值，β (ρ X 1)是相关系数，e (η X 1)代表了不能被模型 解释的误差。
[0019] DPLS-UVE是一种基于分析β相关系数的变量筛选方法，通过交互验证计算相关系 数的矩阵β =[仇，…，βΡ]，模型可靠性的临界值W是相关系数比和标准偏差s(^)的比值， 计算式见以下方程： j = 1, 2, ···, P 为了估计临界值，在数据集中加入一个和原X矩阵一样大小的随机矩阵，用于模拟噪 声，这组数据值并不在模型中。计算随机矩阵的W值，用于构建比值的临界值。如果变量j的 Cj值小于随机矩阵的c值（cartif)的最大值，将被视为无信息变量，即如果abs(Cj)〈 abs (max(cartif))，j变量的真实值将被剔除。本实验中，采用一种稳健的方法来计算c值，计算方 法为：Cj = (median (bj)/ interquartile (bj) DPLS-BS-UVE方法:将DPLS-BS与UVE算法相结合，该方法中BS方法用于样本的重采样来 扩大原始的小样本量，UVE用于筛选信息变量作为生物标记物。
[0020] 作为一个优选的技术方案，我们进一步的在步骤（4)中采用Hotelling's T2 Range算法得到强烈界外的观察变量。对于多维正常分布，所有样本的t2值形成Hotelling' s T2 Range图。当t2超过临界值时(0.01作为置信区间），该观察变量被认为是强烈的界外 值，予以剔除。
[0021] 优选地，为了更好地消除含量差异导致的数据掩盖，我们需要对数据集中的数据 进行预处理，采用自标度化的方法，将数据进行变换后，使其所有谱峰在分类中的权重相 同，公式为： 其中，为变量j的方差。
[0022]作为一个优选的实施方案，我们进一步公开在步骤(3)中某一化学位移区间的峰 面积是指采用分段积分的方法，按每段宽度Λδ为〇 . Olppm进行分段积分所获得的峰面积， 具体来说，采用分段积分的方法，积分范围为化学位移如.10-10.0之间，按每段宽度Λδ为 O.Olppm进行分段积分。采用峰面积归一化，得到峰面积积分值的数据。在数据集中，行代表 某一化学位移区间的峰面积，列为样本的种类，用于进一步的统计分析。
[0023]本发明所建立的方法可以用于掺假蜂蜜的快速鉴别中。
[0024] 本发明具有以下优点： Η无损伤性，不会破坏样品的结构和性质，能够真实反应蜂蜜的所有信息；圍|样品前 处理简单，只需要重水溶解，可避免由于分离所造成的微小成分的丢失;?谱图中信号的相 对强弱直接反映了样品中各组分的相对含量;圍;基于DPLS-BS-UVE算法所找的多个标记物， 能够对蜂蜜真假进行快速、精确分类，相对于单一指标而言更加全面、灵敏度高、准确性好。
[0025] 通过DPLS-BS-UVE算法用于蜂蜜掺假标志物的的筛查，与参数检验方法相比，该方 法无需对数据的分布进行先验假设;对于样本量少的数据结构，采用BS方法做样本的重采 样进行扩大样本量避免过拟合现象发生。该方法具有分析时间短、完整性强、专属性好、可 控性强、准确性高等优点，可以弥补目前蜂蜜掺假鉴别方法存在的缺陷。
[0026] 本研究的实施对推动行业科技进步、规范蜂产品市场、保障消费者合法权益以及 促进我国蜂产品事业的健康发展有着十分重要的意义。
【附图说明】
[0027] 图 1