位置512953，SNP 信息 C;
[0043] (5)NW_〇〇3378〇77· 1，位置 l5〇33〇4，SNP 信息 T;
[0044] (6)NW_〇〇3378l3l · 1，位置693133，SNP信息T;
[0045] (7)NW_003378131 · 1，位置860330，SNP 信息 Τ;
[0046] (8)NW_〇〇3378〇9l · 1，位置42〇52〇，SNP信息A;
[0047] (9)NW_003378085.1，位置 1765707，SNP 信息 A;
[0048] (10)NW_003378085.1，位置 1775747，SNP 信息 T;
[0049] (11 )NW_003378085 · 1，位置2595617，SNP 信息 T;
[0050] (12)NW_003378054.1，位置 1502972，SNP 信息 T;
[0051 ] (13) NW_003378088 · 1，位置3767987，SNP信息A;
[0052] (14)NW_003378088 · 1，位置3816341，SNP 信息 C;
[0053] (15)NW_003378088 · 1，位置3914549，SNP 信息 A;
[0054] (16)NW_003378088 · 1，位置4363281，SNP 信息 A;
[0055] (17)NW_003377992.1，位置391791，SNP 信息 T;
[0056] (18)NW_003378010 · 1，位置550054，SNP 信息 A;
[0057] (19)NW_003378027.1，位置356859，SNP 信息 A;
[0058] (20)NW_003378033.1，位置 211517，SNP 信息 T;
[0059] (21 )NW_003377995 · 1，位置360953，SNP 信息 G。
[0060] 如果待测样本中存在至少两个不满足（1)至（21)的所有标准，待测蜜蜂群体为候 选的非中国西域黑蜂群体。
[0061] 本发明公开了一种应用21个SNP鉴定中国西域黑蜂蜂种的方法。本发明提供的辅 助鉴定蜜蜂是否为中国西域黑蜂的方法包括如下步骤:检测待测蜜蜂基于21个SNP位点的 基因型;如果满足（1)-(21)的95%以上的标准，待测蜜蜂为候选的中国西域黑蜂蜂种;如果 不满足上述(1)-(21)的95%以上的标准则待测蜜蜂为候选的非中国西域黑蜂。本发明对中 国西域黑蜂的蜂种种质资源鉴定具有重大价值。
[0062] 本发明的有益效果在于：
[0063] (1)本发明应用全基因组测序技术，测序深度覆盖蜜蜂全基因组基因序列，能够全 面、准确的检测到中国西域黑蜂的特有SNP信息；因此，本专利所列的鉴定中国西域黑蜂的 21个SNP具有全面、准确的特点；
[0064] (2)本专利所列的鉴定中国西域黑蜂的特有的SNP位点在中国西方蜜蜂与其它地 区西方蜜蜂的分化及中国西方蜜蜂对本地环境的适应性进化具有重要作用。
[0065]本发明提供的SNP标记及其应用、检测方法中所用原料与试剂均可由市场购得。
[0066]下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0067] 实施例1
[0068] (1)采集蜜蜂样本，提取DNA，DNA 0D值在1.8-2.0,含量大于1.5微克的样品认为是 合格的；
[0069] (2)合格的DNA样品构建文库:检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成 长度为350bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit进行建库，严格使用说明书 推荐的试剂和耗材。DNA片段经末端修复、加尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个 文库制备。构建好的文库通过illumina HiSeq进行测序。
[0070] (3)库检:文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至lng/μL，随 后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM)，以保证文库质量。
[0071] (4)上机测序：库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行illumina HiSeq测序。
[0072] (5)质控:测序得到的原始测序序列（Sequenced Reads)或者raw reads，里面含有 带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。数据处理的步骤如下：
[0073] a.去除带接头（adapter)的paired-end reads;
[0074] b.当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除 此对paired-end reads;
[0075] c.当单端测序read中含有的低质量(Q〈 = 5)碱基数超过该条read长度比例的50% 时，需要去除此对paired-end reads。
[0076] (6)序列比对：
[0077] 使用BWA软件进行序列（clean reads)比对，除"_t_k 32-M-R"外，其它参数选择默 认值。以Amel 4.5(来源NCBI)为参考基因组，比对获得的bam文件利用SAMtools软件进行排 序，并移除重复的序列。
[0078] (7)SNP检测：得到bam文件后，我们进行SNP的检测。SNP(单核苷酸多态性)主要是 指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠 换等。我们采用SAMT00LS(mpileup-m2-F 0.002-d 1000)进行个体SNP的检测。为了降低SNP 检测的错误率，选用如下标准进行过滤：
[0079] a. SNP的reads支持数不低于4;
[0080] b.SNP的质量值(MQ)不低于20;
[0081 ] (8) SNP注释:ANN0VA是一种高效的软件工具，它能利用最新的信息，对由多个基因 组检测出的基因变异进行功能注释。只要给出变异所在的染色体、起始位点、终止位点、参 考核昔酸和变异核昔酸，ANN0VAR就能进彳丁Gene-based annotation、Region-based anno tat ions、Filter-based anno tat ion 和Other functionalities 〇 鉴于 ANN0VAR 强大的 注释功能和国际的认可性，我们利用它对SNP检测结果进行注释。
[0082] (9)筛选比对，得到中国西域黑蜂特有的SNP:我们将本研究获得的SNP与主要蜂种 A.m.mellifera,A.m.carnica,A.m.ligustica,A.m.anatoliaca, A.m.scutellata, A. cerana的基因组SNP信息进行比对，筛选出位于基因编码区的、且为非同义突变、仅在中 国西域黑蜂中出现的SNP，就是中国西域黑蜂特有SNP。
[0083] 通过筛选比对，我们得到了中国西域黑蜂特有的SNP具体如下所列：
[0084] (1 )NW_003378074 · 1，位置935827，SNP 信息 T;
[0085] (2)NW_〇〇3378l58.l，位置84 6767，SNP 信息 A;
[0086] (3)NW_〇〇3378〇5l · 1，位置292887，SNP信息C;
[0087] (4)NW_003378051 · 1，位置512953，SNP 信息 C;
[0088] (5)NW_〇〇3378〇77· 1，位置 l5〇33〇4，SNP 信息 T;