与水稻紫色叶鞘qtl紧密连锁的ssr分子标记与应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记与应用，特别涉及水稻的 简单重复序列（SSR，Simple sequence repeats)分子标记及其在水稻紫色叶鞘基因遗传分 析和精细定位中的应用，属于DNA分子标记技术和分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002]分子标记目前广泛应用于种质资源遗传多样性分析以及辅助育种工作中，是育种 工作及遗传学研究重要的不可缺少的工具。尤其是SSR(Akkaya et al.，1992)、RAPD (Williams et al.，1990)等的出现，鉴于其具有简便、高效和快速的特点，使分子标记的开 发与利用遍及各种作物。
[0003] SSR(simple sequence repeat，简单重复序列），又叫微卫星位点 (Microsatellites)，是由1-6个核苷酸的重复单元串联重复而成的序列（Sharma et al.， 2007)，同时是一种基于?〇?(口〇1}0116抑86(3113；[11代3(31：；[011)的0嫩分子遗传标记，广泛分布 于整个植物基因组。同一物种中不同材料的SSR基序重复次数不同，用重复区两侧相对保守 的单拷贝序列设计引物，对基因组总DNA进行扩增，扩增片断的长度多态性可作为不同材料 的特异分子标记。现已证实SSR存在于真核生物和绝大部分原核生物中。传统获得SSR标记 的方法需通过建立、筛选基因组文库、克隆测序、引物设计等一系列实验，耗费许多人力、物 力。而现在，随着基因组测序越来越便捷，由基因组数据中直接开发SSR标记的方法也被运 用得越来越多。目前已在大豆、玉米、小麦、水稻、番茄、棉花等许多作物中开发出大量的SSR 引物，用于这些作物的遗传多样性评价以及其它工作中（Ziekiewicz et al. ,1994; Varshney et al.,2005)0
[0004] 水稻是重要的粮食作物，为世界上一半以上的人口提供食物和营养来源。同时也 是一种重要的战略性物资，占我国粮食总产的一半以上。为此，保障水稻生产对确保我国粮 食安全和农业可持续发展有十分重要的战略意义。水稻具有基因组较小（约389Mb)，遗传转 化系统建立完善以及与其它禾本科植物存在较好的共性等特点，已经成为禾本科植物以及 单子叶植物的模式植物（Izawa and Shimamoto, 1996)。此外，2005年发布的全基因组精细 图谱（IRGSP，2005)为水稻展开在分子水平的研究奠定了优越的便利条件。目前，根据水稻 基因组测序结果已经开发了大量SSR标记(McCouch et al.，2002;Saini et al.，2004; Nonoue et al.，2008;Matsubara et al.，2008;Maas et al .,2010)，但对水稻SSR标记的 开发仍没有饱和。鉴于水稻在粮食安全和农业可持续发展方面重要性，开发新的特异性水 稻SSR引物，对于构建高密度遗传图谱和品种指纹图谱具有重要意义。同时，对于水稻新品 种开发，种子资源评价和栽培技术创新具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记与 应用。上述水稻SSR分子标记为提供多态性，弥补目前水稻SSR标记较为缺乏的不足，为水稻 种质鉴定研究及其群体遗传学提供有力的研究工具。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH10，该分子标记为一对，上游标记 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008] 上述与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH10在紫色叶鞘基因遗传分析 和基因精细定位中的应用。
[0009] 与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH13，该分子标记为一对，上游标记 核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0010] 上述与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH13在紫色叶鞘基因遗传分析 和基因精细定位中的应用。
[0011] 与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH15，该分子标记为一对，上游标记 核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0012] 上述与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH15在紫色叶鞘基因遗传分析 和基因精细定位中的应用。
[0013]有益效果
[0014] 本发明首次筛选出了 3对与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH10、SSR 分子标记PSH13、SSR分子标记PSH15,上述SSR分子标记通过对水稻染色体代换系W23-07-6-02-14和轮回亲本HJX74基因组DNA进行扩增，并利用6%变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检 测，发现上述SSR引物扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，利用上述3组SSR 标记引物能够将水稻紫色叶鞘基因进行遗传分析和精细定位。
【附图说明】
[0015] 图1为水稻染色体代换系上SSR标记RM225和RM253亲本多态性筛选聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测的结果；
[0016] 图中，1为轮回亲本HJX74，2为水稻单片段代换系W23-07-6-02-14，a为RM225多态 性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，b为RM253亲本多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测的结果；
[0017] 图2为水稻SSR标记1?1225、1?119556、1?119561和1?1253在?2群体中的分离中变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果；
[0018] 图中，其中（a)、（b)、（c)和（d)分别为利用SSR引物对RM225、RM19556、RM19561 和 RM253在华粳籼74(P1)和单片段代换系W27-14-1-2-03-24(P2)分离群体中的PSH-6(t)基因 扩增结果；1-20为内群体个体；
[0019] 图3为华粳籼74和染色体代换系W23-07-6-02-14杂交发展的作图群体定位的叶色 基因座PSH-6遗传图；
[0020] 图4为水稻SSR标记PSH02在亲本间的多态性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果； [0021]图中，1-8为?2分离群体单株，9为轮回亲本HJX74，10为水稻单片段代换系W23-07-6-02-14；
[0022]图5为水稻SSR标记PSH02在^群体中的分离中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结 果；
[0023] 图中，1-20为F2群体个体；
[0024] 图6为水稻SSR标记PSH10、PSH13和PSH15在F2群体中的分离中变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测的结果；
[0025] 图中，（a)为SSR标记PSH10在华粳籼74(P1)和单片段代换系W27-14-1-2-03-24 (P2)分离群体中的PSH-6(t)基因扩增结果；（b)为SSR标记PSH13在华粳籼74(P1)和单片段 代换系W27-14-1-2-03-24(P2)分离群体中的PSH-6(t)基因扩增结果；（c)为SSR标记PSH15 在华粳籼74(P1)和单片段代换系W27-14-1-2-03-24(P2)分离群体中的PSH-6(t)基因扩增 结果；l-2〇SF 2群体个体；
[0026]图7为显性紫色叶鞘基因在水稻第6染色体短臂上的分子连锁图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合说明书附图及实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限 于此。以下实施例描述了本发明在第6染色体上水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记 及其应用。
[0028]实施例中所用实验材料来源如下：
[0029]水稻染色体代换系W23-07-6-02-14和轮回亲本HJX74购自华南农业大学农学院；
[0030] 其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。
[0031] 实施例1水稻SSR标记引物的设计
[0032] 1.1引物设计方法：
[0033]在需要发展微卫星标记的染色体区段进行分子标记的设计。从TIGR网站上（The Institute of Genome Research) (http://www. tigr.org/tdb/rice)下载该区域PAC/BAC 克隆的序列。TIGR将IRGSP(International Rice Genome Sequencing Project，IRGSP)已 测序的PAC/BAC克隆整合到了遗传图谱上，从目标区域下载的PAC/BAC克隆的序列首先需要 利用重复序列搜索软件SSRIT(http: //www · gramene · org/microsat/)进行微卫星序列的搜 索，然后从中选择合适的微卫星序列（一般要求重复数在8以上，同时避免基序为AT)，下载 包含有此微卫星序列的一小段基因组序列（350~500bp)，最后利用此序列进行PCR引物的 设计。利用软件Primer Premier 5.0进行引物的设计。设计的引物一般要求GC含量在45~ 65%之间，1'111值在55-65°(3之间，无错配、二聚体和发夹结构。
[0034] 在需要发展缺失多态性标记的染色体区域，从TIGR网站上（The Institute of Genome Research)( http://www.tigr.org/tdb/rice)下载该区域日本晴PAC/BAC克隆的序 列。首先选择需要的PAC/BAC克隆，把每个克隆分割成2kb连续的小片段。然后利用这些2kb 的序列与籼稻品种93-11进行序列比对，选择序列比对相似性高而只在某个区段有碱基缺 失(碱基缺失一般在5个碱基以上）的序列做为候选序列，最后利用这些候选序列在碱基缺 失的两端设计前后引物，扩增出的产物一般控制在l〇〇bp到300bp之间。其它按引物设计的 一般要求。
[0035] 分子标记的物理定位以IRSGP建立的日本晴的假染色体模型(Pseudomolecules) 为参照对象。发明人采用直接物理定位法，即根据IRGSP发表的日本晴的假染色体模型将各 个两个亲本间具有多态性的分子标记直接定位，以构建成分子图谱。具体方法如下：
[0036] 通过NCBI网站BLAST比对工具，对各个分子标记的前后引物序列在日本晴的基因 组序列上进行查找，以确定该分子标记所在的染色体或BAC克隆上，根据比对所得的结果即 可获知该分子标记在各条染色体上的