具体位置。
[0037] 根据分子标记分析的结果，将具有HJX74和W23-07-6-02-14的亲本带型的个体分 别赋值1和3,具有双亲带型（杂合带型）的个体赋值2。将微卫星分析的结果转换成数字形 式，然后输入计算机以便采用MAPMAKER/EXP.Version 3.0软件对定位群体抽穗期和微卫星 标记的分离数据进行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(Centimorgan， cM)，构建出目标基因的局部分子连锁图。
[0038] 根据克隆末端的重复序列，BLASTn软件(http: //www.ncbi .nlm.nih · gov/blast) 把各克隆拼接起来，确定新引物所在克隆的物理位置，整合到遗传图上，并计算两标记间的 物理位置。
[0039] 利用Gramene网站上（http : //www · gramene · org)提供的微卫星序列搜索工具 SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool)找出BAC序列中的微卫星序列，然 后用Primer Premier 5.0对微卫星的侧翼序列自动或人工设计出扩增长度为200~1000bp 左右的上下游引物对。引物设计完成以后，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，共合 成6对SSR引物。
[0040] 2.2水稻SSR标记引物在水稻紫色叶鞘基因 PSH-6(t)精确定位中的应用
[0041] 发明人采用SSR标记对F2代次级分离群体进行扩增，初步将紫色叶鞘基因定为在 RM225与RM253之间（如图1所示）。在该基础上，从McCouch的SSR遗传图谱中挑选16对SSR标 记(表1)，挑选出4对标记具有多态性(如图2所示），根据分子标记分析的结果，用MAPMAKER/ EXP Version 3.0软件进行连锁分析，并计算标记间的遗传距离。叶色基因座位PSH-6被定 位到第6染色体上，位于短臂一侧的微卫星标记RM225、RM19556与PSH-6的遗传距离分别为 5.0cM、5.2cM，和位于另一侧的微卫星标记RM19561、RM253与PSH-6(t)的遗传距离分别为 0.2cM、0.2cM。进一步将紫叶基因定位在RM19556和RM19561之间。RM19556和RM19561之间的 遗传距离为〇. 4cM(如图3所示）。
[0042] 表1 16对SSR标记引物序列
[0045] 注："+"表示有多态性，"一"表示无多态性。
[0046] 为了进一步定位目标基因，在已有标记RM19556和RM19561之间所在的区域设计9 对新的引物(表2)。获得引物PSH02具有明显的亲本多态性（图4)。将该显性紫色叶鞘基因定 位于水稻第6染色体短臂PSH02和RM19561之间。
[0047] 表2 RM19556和RM19561之间的9对SSR标记引物序列
[0048]
[0049]
[0050] 注："+"表示有多态性，"一"表示无多态性。
[0051 ] 为了进一步定位目标基因，在已有标记PSH02和RM19561之间所在的区域设计6对 新的引物(表3)。获得引物PSH10、PSH13和PSH15具有明显的亲本多态性（图6)。将该显性紫 色叶鞘基因定位于水稻第6染色体短臂PSH10和PSH13之间，物理距离为23.3kb。
[0052] 表3 PSH02和RM19561之间新的SSR标记引物序列
[0053]
[0054] 注："+"表示有多态性。
[0055] 实施例2水稻SSR分子标记PSH10、SSR分子标记PSH13、SSR分子标记PSH15的应用
[0056] 2.1水稻基因组DNA提取
[0057] 采用改良TPS简易法提取水稻基因组总DNA，具体步骤如下：
[0058] 1.在分蘖盛期每个单株取上部1-2片幼叶，保存与_80°C冰箱中备用；
[0059] 2.抽提DNA时取2-4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加 TPS抽 提液900ml，75°C水浴30-60min;
[0060] 3.12000rpm离心10min，吸取上清约500ml转入新1.5ml离心管；
[0061 ] 4.加入预冷异丙醇或无水乙醇加满。4°C过夜，12000rpm离心10min;
[0062] 5.弃上清，干燥沉淀，加150μ1灭菌水，4°C备用。
[0063] (TPS抽提液：100mM Tris-HCL(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)、lM KCL)。
[0064] 2.2PCR 扩增
[0065] 按照Panaud et al. (1996)的方法稍加修改进行。20μ1反应体系中包括：
[0066] 2XHifi PCR Mix 10yl，50-100ng的DNA模板ΙμL，上游标记ΙμL，上游标记ΙμL， (ΜΗ2〇7μ1，总反应体系为20μ1。
[0067] 扩增在ΡΕ9700型热循环仪中进行。
[0068] 反应程序为:94°C预变性5min; 94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，35个 循环;72°C延伸5min。
[0069] 2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及多态性检测
[0070] PCR产物用6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，基本操作包括以下三个步骤:制胶:称取 9.6g尿素，加 45ml蒸馏水和8ml 10XTBE(108g Tris-HCl、55g硼酸、7.44g EDTA加蒸馏水溶 解，定容至1000ml)，用玻棒搅拌使尿素完全溶解，然后加入12ml 40%丙烯酰胺溶液(38g丙 稀酰胺、2g N，N'_亚甲基双丙稀酰胺，加水定容至100ml)，搅勾，加入0.8ml 10%过硫酸胺 和35μ1 TEMED，搅匀后立即倒入已用琼脂糖凝胶封口的玻璃板中，灌满后放平，使其与桌面 成10°左右的倾角。插入梳子，静置1-2个小时使胶凝固。
[0071]点样:待胶完全凝固后，小心拔出梳子，尽量保持点样孔完整。将玻璃板固定在垂 直电泳槽上，加入适量的1 X TBE电泳缓冲液;取电泳缓冲液反复冲洗点样孔，清除多余没有 凝固的物质;取PCR扩增产物，每管PCR产物中加入4μ1载样缓冲液(0.25 %溴酚蓝、0.25 %二 甲苯氰、50%甘油），混匀后用微量进样器(购自上海医用激光仪器厂)取3-4μ1注入点样孔。 [0072] 电泳:调电压至250V，电泳时间约3-4小时。
[0073] 电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗两次;转移至 0.1 % AgN03溶液中染色，在摇床上轻摇10分钟;然后将凝胶转移至蒸馏水中漂洗两次;最后 转入显色液(6g氢氧化钠、0.076g四硼酸钠、1.6ml甲醛，加水定容至400ml)中显色，着色后 转入自来水中保存，记录带型结果或凝胶成像。
[0074] 由图1、2、4、5和6可以看出，水稻SSR标记引物RM225、RM19556、RM19561、RM253、 PSH02和PSH15中扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性。采用上述SSR标记对F2 代次级分离群体进行扩增，初步将紫色叶鞘基因定为在RM225与RM253之间。在该基础上，从 McCouch的SSR遗传图谱中挑选16对SSR标记，挑选出5对具有多态性的标记，进一步将紫色 叶鞘基因定位在RM19556和RM19561之间。RM19556和RM19561之间的遗传距离为0.4cM。在已 有标记RM19556和RM19561之间所在的区域设计9对新的引物。获得引物PSH02具有明显的亲 本多态性。在PSH02和RM19561之间发展6对新的SSR标记，其中，有3对标记在亲本间具有明 显多态性。最终将该显性紫色叶鞘基因定位于水稻第6染色体短臂PSH10和PSH13之间，物理 距离为23.3kb的片段上。并通过水稻基因组注释系统（RiceGAAS)对PSH10和PSH13之间 23.3kb的染色体区域进行了基因预测及功能分析。在这区域内发现含有4个ORFs，其中 GENE3与色素原基因 C的合成有关，初步推测其为目标基因 PSH-6(t)。利用本申请所述的SSR 分子标记PSH10、PSH13和PSH15能够将水稻紫色叶鞘基因进行遗传分析和精细定位。同时可 用于水稻构建高密度遗传图谱和品种指纹图谱。
【主权项】
1. 与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH10，该分子标记为一对，上游标记核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 权利要求1所述与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH10在紫色叶鞘基因 遗传分析和基因精细定位中的应用。3. 与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH13，该分子标记为一对，上游标记核 苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4. 权利要求3所述与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH13在紫色叶鞘基因 遗传分析和基因精细定位中的应用。5. 与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH15，该分子标记为一对，上游标记核 苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。6. 权利要求5所述与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH15在紫色叶鞘基因 遗传分析和基因精细定位中的应用。
【专利摘要】本发明涉及与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记与应用。与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH10，上游标记核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。以及与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH13和与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH15。本发明首次筛选出了3对与水稻紫色叶鞘QTL紧密连锁的SSR分子标记PSH10、SSR分子标记PSH10、SSR分子标记PSH10。利用上述3组SSR分子标记能够将水稻紫色叶鞘基因进行遗传分析和精细定位，可用于构建水稻高密度遗传图谱和品种指纹图谱。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105525026
【申请号】CN201610093553
【发明人】姚方印, 陈高, 柳絮, 张华 , 宣宁, 杨永义
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月19日