一种控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因及其检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程【技术领域】，具体公开了一种控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因，该基因具有SEQIDNO：1、SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示的核苷酸序列，将所述基因导入苗期白化转绿的植株，其转化植株苗期第二叶和第三叶的叶色变绿，将所述基因通过物理或化学的方法进行突变，并将突变基因通过杂交和回交的方式导入不育系，通过叶色差异以及PCR扩增可以方便、快捷的检测杂交水稻不育系以及与它配制的杂交水稻的纯度，从而为水稻育种技术提供理论支持。
【专利说明】一种控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物【技术领域】，更具体地，涉及一种控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002]叶色变异是比较常见的突变性状，一般在苗期表达。由于突变基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以叶色突变材料也称为叶绿素突变材料。高等植物叶绿体是进行光合作用的场所，而叶绿体的发育不仅取决于叶绿体基因组编码基因的表达，同时受一系列核基因的控制。研究表明控制叶绿体发育的核质基因发生突变可导致叶绿体发育受阻，引起植物叶色发生异常，甚至导致植物白化而无法进行光合作用。
[0003]叶绿体突变材料的来源十分广泛，包括自然突变、人工诱发突变、插入突变和基因沉默突变。自然突变在自然条件下发生，未经过复杂的生物技术操作手段，将其直接用于常规育种，不存在转基因安全性的问题。人工诱发突变是创造新种质、选育新品种的有效途径。
[0004]目前，叶色突变材料已广泛应用于基础研究和生产实践。例如，在种子纯度鉴定方面，利用隐性叶色突变性状可完全克服由于外来花粉的烦扰，确保良种的纯度及质量；在杂交育种方面，可将叶色变异性状导入杂交亲本，还可以在苗期(间苗或移栽时)及时剔除亲本自交后代，从而大大简化杂交种生产。
[0005]现在有很多研究工作者利用物理、化学、生物等诱变方法创建水稻叶色突变材料，研究其生理和相关基因功能并作为可视标记应用于水稻的遗传育种。本研究利用组织培养过程中得到的控制水稻苗期第二和第三叶白化但后期转绿的突变材料，并通过图位克隆技术克隆了相关基因。至今尚未有与此基因相关的文献报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服水稻叶绿体基因研究技术的不足，提供一种控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因。
[0007]本发明的第二个目的是提供上述控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因所编码的蛋白质。
[0008]本发明的第三个目的是提供含有上述基因的载体。
[0009]本发明的第四个目的是提供含有上述载体的重组体。
[0010]本发明的第五个目的是提供检测上述控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的特异性引物。
[0011]本发明的第六个目的是提供所述控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的检测方法。
[0012]本发明的第七个目的是提供上述基因或含有上述基因的载体或重组体在水稻亲本或杂交种纯度检测中的应用。
[0013]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:U SEQID NO:3或SEQ ID NO:4所示；基因的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，包括启动子的基因组序列如SEQ ID N0:3所示；其cDNA序列如SEQ ID NO:4所示，水稻中该控制第二和第三叶的叶绿体发育的基因被破坏，即可导致水稻第二和第三叶白化，而第四叶和更上叶位叶片的叶绿体正常发育，植株正常抽穗结实。
[0014] 申请人:在组织培养中获得一株苗期第二和第三叶白化转绿的植株(苗期白化转绿的植株)，对该植株进行测序，并将其与苗期第二和第三叶叶色为绿的植株的基因进行对t匕，即将该苗期白化转绿的植株与籼稻“培矮64S”配制杂交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将控制叶绿体发育的基因定位在水稻第7染色体，并将其克隆分离出来。
[0015]本发明还提供了上述基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述蛋白是一个与在动物中广泛存在的线粒体转录终止因子(mitochondrialtranscript1n terminat1n factor, mTERF)同源的蛋白。
[0016]含有上述控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的载体。
[0017]含有上述载体的重组体，该重组体可以是将上述叶绿体发育基因以任一种方法与任一种载体相结合形成的重组体。
[0018]本发明还提供了一对用于检测所述控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的特异性引物，其核苷酸引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0019]本发明还提供了控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的检测方法:用上述特异性引物对水稻DNA进行PCR扩增反应，得到长度为3039 bp的核苷酸片段，说明含有SEQ ID NO:3所示的基因。
[0020]本发明还提供了上述基因在水稻杂交种纯度检测中的应用，优选地，用所述基因进行水稻基因型或表型鉴定，并判断杂交水稻亲本和杂交种的纯度；其操作可以是通过物理或化学的方法将上述控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因进行突变获得突变基因，经测序该突变基因中的碱基缺失，mRNA不表达，则水稻早期第二和第三叶白化；将上述突变基因通过杂交和回交导入不育系。利用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的特异引物进行PCR，或播种不育系，在三叶幼苗期观察水稻叶子的白化率，从而检测不育系种子的纯度，具体为:将携带上述突变基因的不育系与父本(含有野生型叶绿体基因)杂交制种。在杂种F1中，所述基因为杂合型，野生型等位基因的功能使真杂种的苗期叶色正常绿色，而由不育系自交产生的种子即假杂种的苗期第二和第三叶表现白化。因此可依此鉴定杂种纯度，并可在育秩苗圃拔除白化苗，提闻杂种纯度。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种新的控制水稻第二和第三叶绿体发育的基因，将所述基因导入苗期白化转绿的植株，其转化植株苗期第二叶和第三叶的叶色变绿，将所述基因通过物理或化学的方法进行突变，并将突变基因通过杂交和回交的方式导入不育系，通过叶色差异以及PCR扩增可以方便、快捷的检测杂交水稻不育系以及与它配制的杂交水稻的纯度，从而为水稻育种技术提供理论支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为台中65和苗期白化转绿的植株基因组DNA的PCR扩增检测图。
[0023]图2为台中65和苗期白化转绿的植株的基因的RT-PCR结果图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0025]实施例1水稻第二和第三叶的叶绿体发育基因的定位本发明用图位克隆法克隆水稻第二和第三叶绿体发育的基因。
[0026] 申请人:在组织培养过程中获得了苗期白化转绿的水稻植株，该植株在水稻苗期第二叶和第三叶白化，后期转绿， 申请人:将该植株与籼稻“培矮64S”配制杂交组合，构建遗传群体，选取1356个隐性纯合突变F2个体作为遗传做图和定位群体，利用SSR和InDel分子标记将目标基因精细定位在第7染色体分子标记724273与724303之间，物理距离约为162
kb ο
[0027]实施例2水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的分离克隆
1、水稻DNA的提取
根据分子克隆实验手册进行操作，包括以下步骤:
(1)取水稻(台中65)幼苗期叶片约0.5g，把叶片剪碎，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末后，放入2 mL离心管中，加入800 μ L 2XCTAB抽提缓冲液，混匀，65°C水浴30min ；
(2)加入等体积的氯仿、异戊醇和无水乙醇(76:4:20)，振荡10 min，充分混匀；
(3)在12000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，混匀，12000转/分离心2min，去上清，用0.5ml 70%的乙醇漂洗两次，风干，溶于100-200 μ L 0.5 X TE缓冲液中；
(4)取Iμ L用于后续的PCR扩增反应。
[0028]2、PCR扩增和基因检测
(一)获得控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因，具体操作如下:
PCR反应体系包括无菌水16.2μ?, 1Xbuffer 2μ?, 10Mmol/L上下游引物(引物序列如SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示)各 0.2μ?，2.5mmol/L dNTPs 0.2μ?,5 υ/μ? Taq DNA 聚合酶0.2μ?, 50ng/^L模板DNA Ιμ?,反应体系的总体积为20 μ I。
[0029]SEQ ID NO:5:5，-CGAGGGTGGTTGGAGAGGAAG-3’
SEQ ID NO:6:5’ - GGAGCCGCACGTTGGTCTGCA-3’
PCR的反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸180s，30个循环；72°C延伸5min。
[0030]扩增得到的台中65的PCR产物长度为3.0kb(图1所示);其核苷酸序列如SEQ IDN0:3所示。由以上结果可知:采用上述特异性PCR引物对水稻所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到3039 bp的核苷酸片段，说明含有控制控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的野生型基因(SEQ ID NO:3)，而白化转绿植株的基因扩增片段为1756bp JBSEQ ID ΝΟ:11所示。所述白化转绿植株的基因是在野生型基因(SEQ ID NO:3)的-1245bp至+38bp处发生1283bp的缺失。
[0031]参照NCBI网站上获得的水稻台中65的ORF序列，设计特异性RT-PCR引物，引物序列如 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 所示。
[0032]SEQ ID NO:7:5，- ATGGCGCCGCCTCCGCCGC-3，
SEQ ID NO:8:5’ - CTACCGCCTCGATGTTAATG-3’
对提取的正常植株cDNA进行扩增，其目的片段长度为1512bp，并进行测序，如SEQ IDNO:4所示。将测序得到的DNA序列即编码序列利用DNAStar软件翻译成氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0033](二)检测控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因和苗期白化转绿的植株的基因，具体操作如下:
PCR反应体系包括无菌水16.2μ?, 1Xbuffer 2μ?, 10Mmol/L上下游引物(引物序列如SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 所示)各 0.2μ?，2.5mmol/L dNTPs 0.2μ?,5 υ/μ? Taq DNA聚合酶0.2μ?，模板为0.5μ?台中65或苗期白化转绿的植株幼苗叶片总RNA的RT产物，反应体系的总体积为20 μ L。
[0034]SEQ ID NO:9:5’ -GTCTGACTCAGGTGTTGTC-3’
SEQ ID NO:10:5’ -TACCGCCTCGATGTTAATG-3’
PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C延伸5min。
[0035]将得到的扩增产物上样，于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色后并在紫外观察仪上成像如图2所示，在台中65中可以扩增出一条300bp的产物，而白化转绿植株则无长度为300bp的扩增产物。
[0036]实施例3水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的功能验证
采用物理、化学方法诱变并破坏水稻中SEQ ID NO:1的基因序列。经测序该基因中的碱基缺失，其mRNA不表达，水稻早期第二和第三叶白化。该基因的功能互补实验结果表明含有该正常基因的苗期白化转绿后代植株第二和第三叶呈绿色，能正常抽穗结实。
[0037]水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因的功能验证包括以下步骤:
(I)利用SSR和InDel分子标记对苗期白化转绿植株的突变基因进行定位，通过测序和半定量RT-PCR分析，表明该基因序列发生突变并导致该基因表达沉默。
[0038](2)将SEQ ID NO:1的核苷酸序列以及该基因翻译起始密码子ATG上游长度为
2.3kb的启动子序列和终止密码子TAG后长度为1.5kb的DNA序列连接到植物转化载体PCAMBIA1300上，经酶切、测序检测验证为该目的基因序列。
[0039](3)利用农杆菌介导的转基因技术，将上述重组载体转化苗期白化转绿植株的愈伤组织，通过PCR扩增方法鉴定第一代阳性转基因植株，其叶色为绿色。
[0040](4)萌发并种植第一代转基因植株种子，其第二和第三叶的叶色出现分离，呈现绿色和白化表型，并符合孟德尔遗传分离比例。
[0041]实验结果表明，水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因正常表达时，水稻植株叶色呈绿色，将该正常基因导入苗期白化转绿植株后所得的子代，其叶色性状发生分离，因此可以通过此表型变化来鉴别水稻品种的真伪，提高种子纯度。
【权利要求】
1.一种控制水稻第二和第三叶的叶绿体发育的基因，其特征在于，其核苷酸序列如32010勵:1、3即10勵:3或3即10勵:4所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，具有3即10勵:2所示的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述基因的载体。
4.含有权利要求3所述载体的重组体。
5.一对用于检测权利要求1所述基因的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列如820 10勵:5和3即10勵:6所示。
6.权利要求1所述基因的检测方法，其特征在于，用权利要求5所述引物对水稻0嫩进行？(?扩增反应，若得到长度为3039恥的核苷酸片段，说明含有3即10顯:3所示的基因序列。
7.权利要求1所述基因在水稻亲本或杂交种纯度检测中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK104404055SQ201410744218
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】刘耀光, 张群宇, 薛德星, 李晓瑜, 龙云铭 申请人:华南农业大学