专利名称：：与水稻紫叶鞘基因PSH1(t)连锁的分子标记及其获得方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及与水稻紫叶鞘基因尸5^7"J连锁的分子标记及其获得方法和应用，属于分子遗传学领域。
背景技术：
：水稻是我国的重要粮食作物。形态1$状在水稻的遗传改良和图谱构建过程中起着重要的作用。在目前传统的育种过程中，育种者仍把易于识别的形态性状作为标记来指导育种。近些年随着杂交水稻在我国的发展，杂交稻种子的纯度鉴定变的越来越重要。选择既在苗期表现明显不同于正常绿叶，而又植株健壮，对产量影响小的叶色标记性状如紫叶、紫叶鞘、淡绿叶，导入到不育系、恢复系，利用叶色标记在苗期帮助检出假杂交种，将是提高杂交稻种子纯度的一种简便有效的方法(曹立勇等，1999;沈圣泉等，2004)。研究表明，紫叶鞘作为水稻重要的农艺性状，在杂交种苗期鉴定中具有很重要的潜在优势。关于叶鞘基因的遗传依据在不同的分离群体已经被研究，结果显示控制紫叶鞘性状的基因有一个或两个主效QTL控制(宋国清等，1994;黄碧光和卢泳全，2002;邱振国，2006)。Bing等(2006)利用重组自交系群体定位了3个与水稻紫叶鞘性状相关的QTL，分别位于水稻第l、6、10染色体上，在第1染色体上位于SSR标记RM129和RM5之间，但是RM129和RM5两标记与紫叶鞘基因所在的基因座的遗传距离并没有报道。目前还没有建立水稻紫叶鞘/^;W(^)基因的分子遗传图谱。本发明人利用水稻品种圣稻301和IRBB60杂交，并连续自交，利用单粒传法，发展了一个包含210家系的重组自交系群体，该群体中编号为RI51的株系带有紫叶鞘性状。利用无紫叶鞘水稻品种香粳9407与紫叶鞘品种RI51杂交产生的F2分离群体，对其带有的紫叶鞘基因尸6^7G;进行定位，建立尸5^fd基因的分子遗传图谱，找到与尸^7^^基因紧密连锁的分子标记基础上，通过紧密连锁的SSR标记的扩增确定紫叶鞘基因是以纯合状态还是以杂合状态存在，才能方便的开展选育研究。借助分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)技术有目的地进行紫叶鞘基因的转育，培育带有紫叶鞘基因的不育系和恢复系，加快育种的进程。并可用于紫叶鞘基因/^)77(^>的克隆。本发明可用来指导紫叶鞘水稻品种的选育研究，与之连锁的分子标记对携有紫叶鞘基因是以纯合或杂合状态存在的单株进行准确选择，大大提高育种效率。同时紫叶鞘基因/^A7(^;分子遗传图谱的构建，对于图位克隆该基因提供了很好的基础。
发明内容本发明的目的是筛选出几个与水稻紫叶鞘基因尸5WG,紧密连锁且不受环境影响的以PCR为基础的分子标记，在苗期就可鉴定出携有紫叶鞘基因是以纯合或杂合状态存在的单株，加快紫叶鞘性状分子标记辅助育种，大大提高选择的效率。同时紫叶鞘基因尸5^7(^分子遗传图谱的构建可加快克隆紫叶鞘基因。与水稻紫叶鞘基因/^^7(^>连锁的分子标记，其特征在于，用标记引物RM7202左端引物序列为AACGTGGAGGCTCCTTTTTC右端引物序列为TTGCTATTAGTTGGTGGGGC标记引物固7318左端引物序列为CCATAGCTGCGTGATTCTCC右端引物序列为AGATGAAACTGGCACGTGTG标记引物賜3475左端引物序列为GTCGGTTTGCCTAGTTGAGC右端引物序列为TTCCTCGGTGTATGGGTCTC标记弓物RM488左端弓物序列为CAGCTAGGGTTTTGAGGCTG右端弓物序列为TAGCAACAACCAGCGTATGC标记弓物RM3143左端弓l物序列为AGCCTGGATAAGATGGTTCG右端弓物序列为CGAGAAGACCCAGTTTCTGC标记弓物RM8260左端弓物序列为AATCTAACGTTTGACTATCCATC右端弓物序列为TCTACCAGTACTCCCTTCACC标记弓物RM246左端弓物序列为GAGCTCCATCAGCCATTCAG右端弓物序列为CTGAGTGCTGCTGCGACT标记弓物RM128左端弓物序列为AGCTTGGGTGATTTCTTGGAAGCG右端弓物序列为ACGACGAGGAGTCGCCGTGCAG扩增水稻基因组DNA获得的扩增片段大小约为157bp、103bp、150bp、177bp、98bp、192bp、116bp和157bp，即为与水稻紫叶鞘基因/^肌(^>连锁的分子标记RM7202标记、RM7318标记、RM3475标记、RM488标记、RM3143标记、RM8260标记、RM246标记和RM128标记，其中标记M488,RM8260,RM3475位于尸5附靠近短臂的一侧，与尸>5^/(^>的遗传距离分别为7.lcM、5.8cM和2.0cM;标记RM7202,RM7318,RM3143,RM246和RM128位于Z^vWG,的另一侧，与尸5附的遗传距离分别为1.lcM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM，离尸淑W基因最近的两侧标记分别为RM3475和RM7202。上述与水稻紫叶鞘基因/^)W(^)连锁的分子标记，是通过以下方法获得的(1)利用水稻品种圣稻301(山东省水稻研究所育成品种，国家种子库均有保存，可对外提供)和水稻品种IRBB60(公知公用材料，国家种子库均有保存，可对外提供)杂交，并连续自交，利用单粒传法，发展了一个包含210家系的重组自交系群体，该群体中编号为RI51的株系带有紫叶鞘性状；(2)利用无紫叶鞘品种香粳9407与紫叶鞘品种RI51(公知公用材料，国家种子库均有保存，可对外提供)杂交，Fi种子自交，产生F2，用CTAB法提取水稻香粳9407、RI51及其Ft、F2分离群体的单株DNA;(3)采用360对均匀覆盖水-超基因组的SSR引物对亲本RI51和香粳9407及其F,进行PCR扩增，进行引物的多态性筛选；筛选出的多态性引物然后依次对F2有紫叶鞘和无紫叶鞘DNA混合池，F2群体的各个体筛选紫叶鞘基因连锁的分子标记；(4)先在第1染色体上筛选出2对多态性引物RM7202，,18，在此区域进行标记加密，共筛选出8对多态性引物RM488，RM8260，RM3475，RM7202，RM7318,RM3143,RM246，RM128;对50个具有隐性性状的无紫叶鞘的&分离群体单株进行分析，确证这8对SSR引物与尸5^7(^>基因连锁；(5)利用这8对引物对420个分离群体单株的F2进行分析，获取群体基因型资料；(6)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻尸5WG;基因的遗传图谱，采用软件MAPMAKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传图距(cM);显性紫叶鞘基因尸5iW(^)被定位在第l染色体上，SSR标记M488，RM8260，RM3475位于,5F7(^,靠近短臂的一侧，与",的遗传距离分别为7.lcM、5.8cM和2.OcM;SSR标记RM7202，RM7318,RM3143,RM246和RM128位于尸5W",的另一侧，与W肌("d的遗传距离分别为1.lcM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM;离尸6X7(^,基因最近的两侧标记分别为RM3475和RM7202。本发明与水稻紫叶鞘基因/^氾(^>连锁的分子标记专用于水稻紫叶鞘品种的选育与种质资源的利用，并可用于克隆紫叶鞘基因。本发明所提供的带有紫叶鞘性状水稻品种RI51的紫叶鞘基因/^A7(^)的分子标记方法，具有以下优点(1)标记稳定，不受环境影响。通过本发明在国际上首次利用SSR标记定位了水稻RI51的紫叶鞘基因Z^vW"人构建了紫叶鞘基因的分子遗传图谱。无紫叶鞘品种香粳9407X紫叶鞘品种RI51组合的亲本，&和F2分离群体部分单株，于2007年在不同生育期取样，用这些标记进行检测，标记表现稳定，不受环境影响。(2)通过本发明分子标记定位的主基因座位位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因座连锁的分子标记，可以预测紫叶鞘基因是以纯合或杂合状态基因型存在的单株，加快紫叶鞘性状分子标记辅助育种，大大提高选择的效率。其检测方便快速，不受环境影响。(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在杂交稻生产中，由于不育系或恢复系不稳定，造成种子混杂，一直是影响杂种纯度的主要因素之一。把紫叶鞘基因转育到不育系或恢复系中，培育带有紫叶鞘性状的不育系或恢复系，在苗期既可进行人工去杂。因此利用与紫叶鞘基因紧密连锁的分子标记进行辅助育种，判断紫叶鞘基因是以杂合和纯合存在，准确地选择在紫叶鞘基因座上纯合的具有优异性状单株，而且能够有目标地将紫叶鞘基因在实验室选择得到，大大提高选择的效率。(4)用于克隆紫叶鞘基因尸6^(^的研究。图位克隆紫叶鞘基因尸5F7&,的前提在于获得尸5^/(^"基因紧密连锁的分子标记。分子标记RM3475和RM7202是目前与尸5)776^基因最紧密连锁的分子标记。图1为水稻品种RI51紫叶鞘基因尸6^7(^,在第1染色体上的位置。图2为标记RM7318对无紫叶鞘品种香粳9407XRI51F2代分子标记辅助选择电泳图谱Pl，香粳9407;P2，RI51;1-20，卩2分离单株。图3为标记RM7202对无紫叶鞘品种香粳9407XRI51&代分子标记辅助选择电泳图谱Pl，香粳9407;P2，RI51;1-20，&分离单株。具体实施例方式(一)无紫叶鞘品种香粳9407与紫叶鞘品种RI51杂交F2群体的创建和表型鉴定(1)2000年至2005年利用圣稻301和水稻品种IRBB60杂交，并连续自交，利用单粒传法，发展了一个包含210家系的重组自交系群体，该群体中编号为RI51的株系带有紫叶鞘性状。(2)2006年无紫叶鞘品种香粳9407XRI51杂交，2006年年底R种子送海南岛三亚加代，自交产生F2种子。2007年将F2分离群体播种于山东省水稻研究所实验农场，5月1号播种，6月20号插秧，单株插植。插秧20天抽提F2分离群体的单株DNA,并调査单株的叶鞘性状，分紫叶鞘和绿叶鞘两种表型。(二)RI51/香粳9407F2群体的分子标记分析(1)用CTAB法提取香粳9407/RI51&各单株DNA。(2)SSR分析参照Panaudetal.(1996)的方法。20plPCR反应体系为:模板DNA10ng/nl，0.15|al10mMdNTPs，1.5个单位的r^酶，2|iillOXPCRbuffer(含MgCl》，1.5pl的2uM正向和反向引物，反应体积20pl。PCR反应程序为DNA94。C预变性5min，然后94°C变性1min，55°C退火lmin，72。C延伸lmin，最后72。C延伸5min。在PTO200PCR仪上进行扩增，扩增产物在6%聚丙烯酰胺胶上进行分离电泳，银染参照李文涛等(2002)的方法进行显色观察，记录实验结果。(3)选择具有紫叶鞘性状30株的DNA等量混合，构成紫叶鞘混合池，选择无紫叶鞘性状30株的DNA等量混合，构成无紫叶鞘混合池。选择两混合池中表现有多态性的引物，对无紫叶鞘性状的50个隐性单株进行扩增，根据表型和基因型进行分析，进一步证明在两混合池中表现多态性的引物与紫叶鞘基因P5^7(^连锁。然后利用鉴定出的与紫叶鞘基因尸5W(^)连锁的SSR标记对F2分离群体的420个单株进行扩增，获取F2群体各单株的基因型资料。(4)根据水稻基因组遗传图谱的遗传图距，选择360对SSR分子标记，保证每隔5cM之内选择一个标记，所选标记均匀覆盖整个水稻基因组。利用这些标记首先对上述亲本及其Fi进行多态性筛选，然后依次对F2有紫叶鞘和无紫叶鞘DNA混合池，并对无紫叶鞘性状的50个隐性单株进行扩增，判断标记与目标基因连锁，然后利用筛选出的阳性标记，对F2群体的各个体进行基因型标记。SSR引物序列来源于http:〃www.gramene.org/网站。由北京赛百盛基因技术有限公司合成。(5)按照Mapmaker的要求将与RI51相同带型的个体赋为1，与香粳9407相同带型赋为3，具有杂合带型的个体赋为2，数据缺失的记为0，利用MAPMAKER/EXP3.0软件对420单株进行分析，构建SSR标记遗传图谱。并利用Kosambi函数转换为遗传距离(cM)。(三)结果与分析(1)在F2分离群体中，调查了760个单株的表型，其中紫叶鞘性状的单株574株，具有无紫叶鞘性状的单株186株(带有绿叶鞘)，具有紫叶鞘性状和无紫叶鞘性状的单株分离比例很好的符合3:1(x^l.38〈x2。.。5,3.84)，证明紫叶鞘性状为显性，并由一对主基因控制。(2)利用360对引物对亲本香粳9407与RI51之间多态性筛选中，有156对SSR引物在9407与RI51之间存在多态性。利用这156对多态性引物对DNA混合池进行扩增，发现在第1染色体上，有两个标记RM7202和RM7318在有紫叶鞘性状和无紫叶鞘性状的DNA混合池中表现差异，进一步对此区域的引物进行筛选，又筛选到6对引物RM488,RM8260,RM3143,RM3475，RM246，RM128在紫叶鞘和无紫叶鞘性状混合池中表现差异。这8对SSR引物的序列和扩增片段大小见表1。为了进一步证明这8对标记与紫叶鞘基因尸5iW(^)连锁，利用这8对SSR引物对F2分离群体中的50个具有绿叶鞘隐性性状的单株进行扩增，基因型分离比例明显偏离1:2:1分离比例，并且绝大部分基因型与表型共分离，证明这8对SSR标记与紫叶鞘基因PSH1(t)连锁。然后利用这8对引物对F2分离群体随机选取的420个单株进行扩增。把基因型和表型数据输入计算机，利用MAPMAKER/EXP3.0程序进行连锁分析，建立了紫叶鞘基因尸6^("d的分子遗传图谱，离两个最近的分子标记RM3475和RM7202距离分别为2.0cM和1.lcM。因此利用这些与紫叶鞘基因"y"连锁的分子标记可以有效地开展紫叶鞘基因的分子标记辅助选择和紫叶鞘性状的分子育种，同时利用大的分离群体，对紫叶鞘基因座进行物理作图，把尸5F/^;基因界定在一个更小的区间，加快紫叶鞘基因的克隆。'表l.标记引物的序列及扩增片段大小<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>核苷酸序列表〈110〉山东省农业科学院高新技术研究中心〈120〉与水稻紫叶鞘基因PSHl(t)连锁的分子标记及其获得方法和应用〈140〉200810014910x〈141〉2008—03—31〈160〉16〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(0ryzasativa)基因组DNARM7202左端引物〈400〉1aacgtggaggctcctttttc20〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM7202右端引物〈400〉2ttgctattagttggtggggc20〈210〉3〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM7318左端引物〈400〉3ccatagctgcgtgattctcc20〈210〉4〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM7318右端引物〈400〉4agatgaaactggcacgtgtg20〈210〉5〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM3475左端引物〈400〉5gtcggtttgcctagttgagc20〈210〉6〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM3475右端引物〈400〉6ttcctcggtgtatgggtctc20<210〉7〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM488左端引物〈400〉7cagctagggttttgaggctg20〈210〉8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(0ryzasativa)基因组DNA賜488右端引物〈400〉8tagcaacaaccagcgtatgc20〈210〉9〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(0ryzasativa)基因组DNARM3143左端引物〈400〉9agcctggataagatggttcg20〈210〉10〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM3143右端引物〈400〉10cgagaagacccagtttctgc20〈210〉11〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(0ryzasativa)基因组DNARM8260左端引物〈橋11aatctaacgtttgactatccate23〈210〉12〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM8260右端引物〈400〉12tctaccagtactcccttcacc21〈210〉13〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(0ryzasativa)基因组DNARM246左端引物〈400〉13gagctccatcagccattcag20〈210〉14〈211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM246右端引物〈400〉14ctgagtgctgctgcgact18〈210〉15<211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(Oryzasativa)基因组DNARM128左端引物〈400〉15agcttgggtgatttcttggaagcg24〈210〉16<211〉22<212〉瞧〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增水稻(0ryzasativa)基因组DNARM128右端引物〈400〉16acgacgaggagtcgccgtgcag2权利要求1.与水稻紫叶鞘基因PSH1(t)连锁的分子标记，其特征在于，用标记引物RM7202左端引物序列为AACGTGGAGGCTCCTTTTTC右端引物序列为TTGCTATTAGTTGGTGGGGC标记引物RM7318左端引物序列为CCATAGCTGCGTGATTCTCC右端引物序列为AGATGAAACTGGCACGTGTG标记引物RM3475左端引物序列为GTCGGTTTGCCTAGTTGAGC右端引物序列为TTCCTCGGTGTATGGGTCTC标记引物RM488左端引物序列为CAGCTAGGGTTTTGAGGCTG右端引物序列为TAGCAACAACCAGCGTATGC标记引物RM3143左端引物序列为AGCCTGGATAAGATGGTTCG右端引物序列为CGAGAAGACCCAGTTTCTGC标记引物RM8260左端引物序列为AATCTAACGTTTGACTATCCATC右端引物序列为TCTACCAGTACTCCCTTCACC标记引物RM246左端引物序列为GAGCTCCATCAGCCATTCAG右端引物序列为CTGAGTGCTGCTGCGACT标记引物RM128左端引物序列为AGCTTGGGTGATTTCTTGGAAGCG右端引物序列为ACGACGAGGAGTCGCCGTGCAG扩增水稻基因组DNA获得的多态性片段大小约为157bp、103bp、150bp、177bp、98bp、192bp、116bp和157bp，即为水稻紫叶鞘基因PSH1(t)连锁的分子标记RM7202标记、RM7318标记、RM3475标记、RM488标记、RM3143标记、RM8260标记、RM246标记和RM128标记，其中标记M488，RM8260，RM3475位于PSH1(t)靠近短臂的一侧，与PSH1(t)的遗传距离分别为7.1cM、5.ScM和2.0cM；标记RM7202，RM7318，RM3143，RM246和RM128位于PSH1(t)的另一侧，与PSH1(t)的遗传距离分别为1.1cM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM，离PSH1(t)基因最近的两侧标记分别为RM3475和RM7202。2、权利要求1所述的与水稻紫叶鞘基因尸5^7fd连锁的分子标记，其特征在于，是通过以下方法获得的(1)利用水稻品种圣稻301和IRBB60杂交，并连续自交，利用单粒传法，发展了一个包含210家系的重组自交系群体，该群体中编号为RI51的株系带有紫叶鞘性状；(2)利用无紫叶鞘品种香粳9407与紫叶鞘品种RI51杂交，R种子自交，产生F2，用CTAB法提取水稻香粳9407、RI51及其Ft、F2分离群体的单株DNA;(3)采用360对均匀覆盖水稻基因组的SSR引物对香粳9407和亲本RI51及其F,进行PCR扩增，进行引物的多态性筛选；筛选出的多态性引物然后依次对F2有紫叶鞘和无紫叶鞘DNA混合池，F2群体的各个体筛选紫叶鞘基因连锁的分子标记；(4)先在第1染色体上筛选出2对多态性引物RM7202，RM7318，在此区域进行标记加密，共筛选出8对多态性引物RM488，RM8260，RM3475，RM7202，RM7318,RM3143,RM246,RM128;对50个具有隐性性状的无紫叶鞘的Fz分离群体单株进行分析，确证这8对SSR引物与尸5iW(^>基因连锁；(5)利用这8对引物对420个F2分离群体单株进行分析，获取群体基因型资料；(6)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻尸5)WG;基因的遗传图谱，采用软件MAPMAKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传图距(cM);显性紫叶鞘基因尸6^(^)被定位在第1染色体上，SSR标记M488，RM8260,RM3475位于尸5^/(^靠近短臂的一侧，与<^>的遗传距离分别为7.lcM、5.8cM和2.0cM;SSR标记RM7202,RM7318,RM3143,RM246和RM128位于尸5W("d的另一侧，与尸5W(^>的遗传距离分别为1.lcM、1.4cM，4.9cM、5.8cM和18.9cM;离"y)基因最近的两侧标记分别为RM3475和RM7202。3、权利要求i所述的与水稻紫叶鞘基因/^A7r^连锁的分子标记，其特征在于，专用于水稻紫叶鞘品种的选育与种质资源的利用，并可用于克隆紫叶鞘/^v7/(^基因。全文摘要本发明公开了与水稻紫叶鞘基因PSH1(t)连锁的分子标记及其获得方法和应用，属于分子遗传学领域。提取水稻无紫叶鞘品种香粳9407、紫叶鞘品种RI51及其杂交获得的F<sub>2</sub>分离群体单株DNA。利用360对SSR分子标记对上述两个亲本进行PCR产物多态性筛选，然后依次对F<sub>2</sub>有紫叶鞘和无紫叶鞘DNA混合池，F<sub>2</sub>群体的各个体筛选紫叶鞘基因连锁的分子标记。在第1染色体上构建了紫叶鞘基因PSH1(t)的分子遗传图谱。通过紫叶鞘主基因的分子标记来检测紫叶鞘品种RI51及其衍生品种(系)中是否含有该基因，大大提高紫叶鞘水稻的选择效率。本发明专用于水稻紫叶鞘基因的筛选，并用于克隆紫叶鞘基因PSH1(t)的研究。文档编号C12N15/29GK101368181SQ200810014910公开日2009年2月18日申请日期2008年3月31日优先权日2008年3月31日发明者丁汉风,姚方印,姜明松,张晓东,李广贤,李润芳,王文英申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心