用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计新方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体的说是涉及一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计新方法，该方法使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以设计，进而使Arm-PCR多重反应变得简单可行。
【背景技术】
[0002]扩增子摇救多重PCR( amp I icon rescue multiplex PCR,以下简称 Arm-PCR)技术，其原理是针对多重PCR体系中的每个靶序列，分别设计两对套式引物，使其可以形成4种扩增引物组合；由于每个靶序列都有4种可能的扩增模式，从而使得寻找不同靶序列最佳通用的扩增条件变得简单可行，最终实现对多种靶基因的高特异性、高灵敏度的同步扩增。
[0003]LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplificat1n)法是 2000 年由 Notomi 等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上6个区域的4条引物(2条外引物，2条内引物)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65°C左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达109?1010个拷贝数量级。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计新方法，可以使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以成功设计，进而使Arm-PCR多重反应变得简单可行。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计新方法，其是通过以下步骤实现的:
a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物:将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm-PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；
b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR引物的通用接头序列:icubate 2.0在线软件设计出的第一轮引物分为外向引物与内向引物，这与LAMP软件设计出的引物相似，所以将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR弓丨物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物；
c、Arm-PCR反应体系的配制；
d、Arm-PCR反应条件的设定与运行；
e、Arm-PCR产物的毛细管电泳检测:在Arm-PCR第二步扩增所需要的超级引物的5’端要加上荧光标记，才能进行后续的毛细管电泳检测。
[0006]以转基因大豆GTS 40-3-2 NOS终止子和转基因大豆A5547-127为例，引物组是由LAMP软件设计的，将其内向上下游引物的成环弓I物换成Arm-PCR弓丨物的通用接头序列，从而转换成Arm-PCR引物，其引物组包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物F1、反向内引物Ri，用于Arm-PCR的第一步扩增；5 ’端ROX标记的超级上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增，其接头序列与超级引物的序列相同，核苷酸序列分别如下所示:
1.A5547-127 正向外引物 Fo:CACAAGAGTGGATTGATGATCTAG ； A5547-127 反向外引物 Ro:CTCATGCAACCTAACAGATGG ；
A5547-127正向内引物
Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGGTTGGTTGCTGAGGTTG ；
A5547-127反向内引物
Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGCCTATAACAGCAACCACAG ；
2.GTS 40-3-2 NOS 终止子正向外引物 Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT ;
GTS 40-3-2 NOS 终止子反向外引物 Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG ;
GTS 40-3-2 NOS终止子正向内引物
Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC;
GTS 40-3-2 NOS终止子反向内引物 Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT ；
3.超级上游引物Fs:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC ；
超级下游引物 Fs:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT ；
利用Arm-PCR检测引物组进行Arm-PCR反应，包括如下步骤:以转基因大豆A5547-127和转基因大豆GTS 40-3-2 NOS终止子的质粒为模板；PCR扩增反应:在PCR管中配制第一步反应体系:引物液2.5 μ 1，反应液Mix 12.5μ 1，转基因大豆Α5547-127和GTS 40-3-2NOS终止子质粒各2?5μ1，用灭菌去离子水补齐到25μ I ;设置空白对照反应时，用双蒸水代替模板；将配制好的PCR管混匀后离心，并于95°C 15min，94°C 30s,60°C 90s,72°C 60s，15 个循环；94°C 15s，70°C 90s，6 个循环；60°C延伸 30min，最后 4°C保存；第二步PCR反应体系为:超级引物液I μ 1，反应液Mix 12.5 μ 1，第一步PCR反应产物I?2μ 1，用灭菌去离子水补齐到25 μ I ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于95°C 15min ；94°C 30s,60°C 90s, 72°C 60s, 30个循环；60°C延伸30min，最后4°C保存；结果判断:通过毛细管电泳检测Arm-PCR扩增结果。
[0007]本发明的有益效果是:icubate 2.0开放平台是网上的免费多重PCR试剂设计软件，由于icubate 2.0软件对靶基因的长度有要求，通常在100bp以上，这样对于小片段的靶基因就无法设计Arm-PCR引物，且icubate 2.0软件设计出的Arm-PCR引物只有两组，从而限制了多重引物组的筛选。而LAMP软件设计出的引物也包含2条外引物和2条内引物，与icubate 2.0软件设计出的Arm-PCR引物相似，只要将LAMP软件设计出的内向上下游引物的成环引物换成Arm-PCR引物的通用接头序列,从而转换成Arm-PCR引物。而且LAMP软件设计出的引物组较多，有利于多重引物组的筛选，本发明用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计新方法，可以使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以成功设计，进而使Arm-PCR多重反应变得简单可行。
【附图说明】
[0008]图1是实施例1转基因大豆A5547-127的Arm-PCR毛细管电泳检测结果图；
图2是实施例1GTS 40-3-2 NOS终止子的Arm-PCR毛细管电泳检测结果图；
图3是空白对照组的毛细管电泳检测结果。
【具体实施方式】
[0009]以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0010]实施例1:一种用于多靶点基因扩增的Arm-PCR引物设计新方法，其是通过以下步骤实现的:a、用LAMP软件代替icubate2.0在线软件设计小片段靶基因的引物:将靶基因片段的序列导入LAMP软件中，按照Arm-PCR引物设计的参数对LAMP软件中的参数进行调整；b、将LAMP软件设计出的内引物前面的成环弓I物序列换成Arm-PCR弓丨物的通用接头序列:icubate2.0在线软件设计出的第一轮弓I物分为外向弓I物与内向引物，这与LAMP软件设计出的引物相似，所以将LAMP软件设计出的内引物前面的成环引物序列换成Arm-PCR弓丨物的通用接头