一种检测蓝狐物种成分的特异性引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测蓝狐物种成分的特异性引物及其应用，属于动物源性成分特 异性检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 蓝狐也称北极狐，是属于犬科、北极狐属的毛皮动物，在我国作为特种养殖动物已 有几十年的历史。蓝狐皮张性能优良，深受裘皮市场的青睐。近年来，蓝狐的毛皮制品市场 需求量很大，养殖数量也不断扩大。冬季取皮后，蓝狐肉作为副产物，往往被添加到动物饲 料甚至是食品中。目前我国畜牧业行业中针对于毛皮动物肉的检验检疫相关管理规定仍处 于空白阶段，对于毛皮动物肉营养价值的研宄很少，并且人们对于食用毛皮动物蓝狐肉存 在认识上的误区，有些地区受到风俗习惯的影响，从心理上很难接受。
[0003] 蓝狐养殖每年产出皮张数量达4000万张，蓝狐胴体重量达20万吨，有的经酸化等 处理用作饲料，由于蓝狐胴体价格较便宜，受到利益驱使，常有不法商贩将蓝狐肉掺杂在羊 肉等其他肉制品中销售，这样不仅侵害了消费者的利益，而且极有可能传播疾病，对人类健 康造成危害。因此，提供一种能够快速准确检测蓝狐源性成分的方法十分必要。传统感官方 法鉴定蓝狐等畜产品源性成分，依据色泽、气味、组织性状等进行判断，受到很多条件的限 制。一旦是添加了色素、芳香剂以及受到深度加工的制品，增加了鉴定难度以及监控监管的 风险性。基于PCR技术建立起来的方法已经成功应用在一些常见家畜、家禽物种中，如牛， 马，鸡等源性成分的鉴定，技术条件成熟，已有检测试剂盒问世。目前，仍然没有从分子水平 对蓝狐物种源性成分进行快速鉴别、鉴定的方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种检测蓝狐物种成分的特异性引物及其应用， 所采取的技术方案如下：
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种检测蓝狐物种成分的特异性引物，该引物是以赤 狐物种的线粒体全基因组序列为参考序列，筛选出蓝狐线粒体基因组中进化速率较快的区 段，根据相应区段设计引物，最后对引物进行特异性验证后筛选出的引物。
[0006] 优选地，所述引物是以GENBANK:GQ374180. 1区段为模板设计得到的特异性引物。
[0007] 所述引物的正向引物和反向引物的核苷酸序列如下：
[0008] 正向引物：5,-ACATTCATACTATTCATACTGACG-3' ；
[0009] 反向引物：5' -GACAACAATTATATCATTTTTTGTTAG-3'。
[0010] 所述引物通过PCR特异性扩增蓝狐线粒体基因片段产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0011] 所述引物用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的蓝狐物种成分。
[0012] 所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反应产物。
[0013] 本发明的另一个目的在于提供了一种含有所述特异性引物的试剂盒，该试剂盒包 括 10 X PCR 缓冲液、I Oumo I /L 正向引物、I Oumo I /L 反向引物、I Oumo I /L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶。
[0014] 优选地，所述试剂盒包括10 XPCR缓冲液、lOumol/L正向引物、lOumol/L反向引 物、lOumol/L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶；
[0015] 其中，正向引物：5' -ACATTCATACTATTCATACTGACG-3'
[0016] 反向引物：5' -GACAACAATTATATCATTTTTTGTTAG-3'。
[0017] 所述试剂盒用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的蓝狐物种成分。
[0018] 所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反应产物。
[0019] 线粒体基因组作为动物细胞核外遗传物质，具有进化快，结构简单，母性遗传等特 点，常常被用作分子进化分析的手段。本发明针对线粒体基因组序列进行分析比对，从NCBI 查找与蓝狐同属不同种的其他动物的线粒体基因组，获得遗传物质DNA信息序列，利用软 件ClustalX进行序列比对，寻找蓝狐的特异性片段序列，在此基础上设计引物，目标是该 引物只能扩增出蓝狐的特异性条带，不能扩增出其他动物的成分，利用电泳图谱比对，从而 将蓝狐成分检测出来。从蓝狐肝脏组织中提取线粒体基因组，利用设计好的引物，摸索适宜 的PCR反应条件，检测结果用电泳验证，同时将扩增条带进行测序分析，与已知相近物种序 列进行比对来验证扩增条带的正确性。
[0020] 本发明获得的有益效果如下：
[0021] (1)操作简单：根据蓝狐相近种属赤狐的物种线粒体基因组特异基因序列设计用 于PCR检测的引物，动物线粒体基因组提取对样本组织进行了前处理、优化了 PCR扩增体系 条件。
[0022] (2)特异性强：提供了一种蓝狐源性成分的PCR检测方法，可准确、快速鉴定蓝狐 源性成分，能够有效抵御假冒动物源性成分产品掺假，在食品、饲料以及皮毛类产品的鉴定 上具有很大的实用价值。同时能有效阻止蓝狐传播的某些疾病病原的传播与蔓延。
[0023] (3)检测条件要求低：本方法只需要具备普通的PCR扩增仪器及常规的化学试剂 药品即可完成。
[0024] (4)本发明优化了肝脏样品前处理方法，可以快速提取线粒体DNA，有效减少了样 本基因组DNA中核基因组的影响，DNA纯度高，提高了检测的灵敏度，针对引物序列采取的 PCR扩增体系也保证了检测的特异性与灵敏度。
[0025] (5)本发明针对蓝狐的物种特异性遗传物质DNA的PCR分子鉴定技术，具有特异性 高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低的特点，能够准确客观的提供实验证 据。
【附图说明】
[0026] 图1为蓝狐肝脏组织线粒体基因组DNA电泳检测图；
[0027] (1、2、3、4均是蓝狐线粒体基因组，M为Marker2000)。
[0028] 图2为蓝狐样本PCR扩增电泳图片；
[0029] (M，Marker2000 ;1，蓝狐特异性引物扩增条带）。
[0030] 图3为检测方法特异性验证电泳图；
[0031] (1，貉；2,水貂；3,犬；4,猪；5,牛；6,羊；7,蓝狐；M，Marker2000)。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0033] 实施例1特异性引物的设计及应用
[0034] (I) PCR检测方法特异性引物的设计
[0035] 下载GenBank中公布的犬科狐属、北极狐属、絡属等动物线粒体全基因组序列，最 终选定与蓝狐种属关系最近、线粒体基因组序列信息较为丰富的赤狐物种的线粒体全基因 组序列，作为本实验设计引物的参考序列，应用生物分析软件CLUSTAL X对16723bp进行细 化比对分析，我们发现在约I. 6kb长度的蓝狐线粒体全基因组序列中有10处进化速率较快 的区段，变异性强的位点初步确定适于设计特异性扩增引物；针对这10个区段周围的基因 序列进行引物设计之前的分析筛选，排除易于产生引物二聚体以及退火温度区间不适宜等 因素干扰的位置，第二轮筛选确定4个区段作为设计引物位点，进一步开展PCR及电泳实验 进行验证，筛选出区段GENBANK:GQ374180. 1用于设计特异性引物，其余区段均不适合设计 特异性引物。根据引物设计规律和碱基配对原则，采用Primer5. 0软件根据GQ374180. 1设 计了特异性引物。4对引物如表1所示：
[0036] 表1设计的4对特异性引物序列
[0037]
【主权项】
1. 一种检测蓝狐物种成分的特异性引物，其特征在于，以赤狐物种的线粒体全基因组 序列为参考序列，筛选出蓝狐线粒体基因组中进化速率较快的区段，根据相应区段设计引 物，最后对引物进行特异性验证后筛选出的引物。
2. 权利要求1所述引物，其特征在于，是以GENBANK:GQ374180. 1区段为模板设计得到 的特异性引物。
3. 权利要求2所述引物，其特征在于，正向引物和反向引物的核苷酸序列如下： 正向引物：5'-ACAITCATACTAITCATACTGACG-3' ； 反向引物：5'-GACAACAATTATATCAiriTITGTTAG-3'。
4. 权利要求2所述引物，其特征在于，通过PCR特异性扩增蓝狐线粒体基因片段产物的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
5. 权利要求2所述引物用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的蓝狐物种成分。
6. 权利要求5所述方法，其特征在于，所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ;进 入循环：94°0变性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循环；终止延伸 ：721：，1〇111111;4°〇 保存反应产物。
7. 含有权利要求1所述特异性引物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10XPCR缓 冲液、10umol/L 正向引物、10umol/L 反向引物、10umol/L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶。
8. 权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10 X PCR缓冲液、10umol/L正 向引物、l〇umol/L 反向引物、10umol/L dNTP 和 5U/uLTaqDNA 聚合酶； 其中，正向引物：5' -ACAITCATACTAITCATACTGACG-3' 反向引物：5'-GACAACAATTATATCAiriTITGTTAG-3'。
9. 权利要求7所述试剂盒用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的蓝狐物种成分。
10. 权利要求9所述方法，其特征在于，所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ; 进入循环：94°0变性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循环 ；终止延伸：721：，1〇111111; 4°C保存反应产物。
【专利摘要】本发明公开了一种检测蓝狐物种成分的特异性引物及其应用，属于动物源性成分特异性检测技术领域。本发明所提供的检测蓝狐物质成分的特异性引物的正向引物和反向引物分别为：正向引物：5'-ACATTCATACTATTCATACTGACG-3'，反向引物：5'-GACAACAATTATATCATTTTTTGTTAG-3'。本发明还提供了含有特异性引物的试剂盒以及利用特异性引物检测肉制品和饲料中蓝狐物种成分的方法。本发明所提供的方法具有操作方便快速、特异性强、检测条件要求低、灵敏度高的特定，适用于肉制品、饲料和毛皮类产品中蓝狐物种成分的检测。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104611456
【申请号】CN201510092862
【发明人】孙伟丽, 李光玉, 王卓, 刘晗璐, 张铁涛, 杨雅涵
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年3月2日