一种基于dnah5基因的结肠癌诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于癌症相关基因检测领域，更具体本发明以DNAH5基因在结肠癌组织 中表达量较正常组织明显下调为基础，涉及一种基于DNAH5基因的结肠癌诊断试剂盒及 DNAH5基因在制备结肠癌诊断试剂盒中的应用，本发明也涉诊断结肠癌的方法。
【背景技术】
[0002] 结肠癌是大肠癌的一种，是国内外常见的恶性肿瘤之一，在40-50岁年龄段发病 率最高，严重威胁着人类的健康和生命。据世界流行病学调查，发现结肠癌在北美、西欧、 澳大利亚、新西兰等地的发病率最高，居内脏肿瘤前二位，但在亚、非、拉美等地发病率则很 低。在我国结肠癌的发病率仅次于胃癌、食管癌，占据消化道肿瘤的第3位。近年来随着人 民生活水平的提高，饮食结构的改变，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势。
[0003] 结肠癌的发病机制尚未完全阐明，但病因学研宄已经表明，绝大部分结肠癌的发 生是一个多步骤、多阶段，环境因素和遗传因素共同作用的复杂过程。它的发生发展涉及多 个基因的改变，表现为多基因多步骤的协同累积以及相互作用。近些年，高通量测序技术的 产生和发展，对基因组学研宄带来了革命性的变革，使得大规模、快速、高效检测基因突变 成为可能，近年来已广泛地应用于检测疾病相关的突变位点。国内外已应用基因芯片及高 通量筛选等技术对结肠癌基因表达谱进行了较多研宄。归根结底结肠癌是一种基因病，是 体内外环境相互作用的结果，它的发生发展涉及多个基因的改变，导致某些基因表达量增 加或降低，如CD44V6的过度表达与消化道肿瘤的淋巴结转移相关，并保护了血管内皮生长 因子（VEGF)的促内皮细胞功能，从而促进了肿瘤血管生成和浸润转移；VEGF诱导survivin 表达上调，高表达的Survivin抑制了各种指向caspase的凋亡机制，从而保护内皮细胞逃 避凋亡。通过上述与结肠癌相关基因表达的检测，可以给结肠癌进行早期诊断提供依据，制 备以相应基因为基础的结肠癌诊断试剂盒。
[0004] DNAH5 (dynein，axonemal，heavy chain 5)基因是参与纤毛或鞭毛运动，基于微管 的运动，细胞定位等的基因，目前的研宄集中在该基因与肺部或纤毛运动障碍等慢性疾病 的相关性方面，而没有关于该基因与结肠癌相关的研宄及介绍。
[0005] 本发明通过对正常组织与结肠癌组织的基因表达的测序分析，得出DNAH5基因在 结肠癌组织中的表达量较正常组织明显下调，是影响结肠癌发生发展的关键基因。进一步 使用荧光实时定量PCR(QPCR)检测临床样本中的DNAH5基因转录表达情况，可以对结肠癌 的发病机理进行探宄，该基因转录表达水平可以为制备基于DNAH5基因的结肠癌诊断试剂 盒提供依据，还可以以该基因为基础制备结肠癌诊断试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明通过对结肠癌与正常组织转录组表达进行高通量测序分析和进一步QPCR 验证，发现DNAH5基因在结肠癌组织中的表达与在正常组织相比明显下调。通过检测DNAH5 基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有结肠癌。
[0007] 本发明的目的在于提供DNAH5基因在制备基于DNAH5基因的结肠癌诊断试剂盒中 的用途及一种基于DNAH5基因的结肠癌诊断试剂盒。
[0008] 根据DNAH5基因的在结肠癌组织中转录水平较正常组织明显下调，可以根据这一 特点，以DNAH5基因为基础为制备基于DNAH5基因的结肠癌诊断试剂盒提供依据。DNAH5基 因在制备基于DNAH5基因的结肠癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于所述诊断试剂盒包含 DNAH5基因荧光实时定量PCR的引物对，所述引物分别为：
[0009] 正向引物序列为 5' -GACCACCGAGGCTCATAAGCAGTT-3'，如 SEQ ID NO :1 所示；
[0010] 反向引物序列为 5' -GCAGGTCTTGGCTGACACCACTATA-3'，如 SEQ ID NO :2 所示。 [0011] 本发明的另一目的是提供一种基于DNAH5基因的结肠癌诊断试剂盒，所述试剂盒 包含DNAH5基因荧光实时定量PCR的引物对，引物对可以根据引物设计的常规设计原则设 计。优选的实施方案中所述引物分别为：
[0012] 正向引物序列为 5' -GACCACCGAGGCTCATAAGCAGTT-3'，如 SEQ ID NO :1 所示；
[0013] 反向引物序列为 5' -GCAGGTCTTGGCTGACACCACTATA-3'，如 SEQ ID NO :2 所示。
[0014] 所述诊断试剂盒还包含扩增管家基因 GAPDH引物对，引物对可以根据引物设计的 常规设计原则设计。优选的实施方案中所述引物分别为：
[0015] 正向引物序列为 5' -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'，如 SEQ ID NO :3 所示；
[0016] 反向引物序列为 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3' 如 SEQ ID NO :4 所示。
[0017] 所述诊断试剂盒还包含SYBR Green PCR反应体系，所述SYBR Green PCR反应体 系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
[0018] 上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域的公知现有技术，优选地，PCR缓冲液 包含：20mMKCl，2. 5mMMgCl2,200mM (NH4)2SO40
[0019] 在本发明的一个具体实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体 系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo (dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶 抑制剂、dNTPs。
[0020] 优选逆转录反应液包含：250mM PH8. 3 的 Tris-HCL，370mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2, 50mM 的 DTT。
[0021] RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争 性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
[0022] 在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂， RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75 %乙醇。
[0023] 本发明的诊断试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。
[0024] 本发明还提供了诊断结肠癌的方法，所述方法包括：
[0025] (1)利用RNA提取试剂提取样本总RNA ;
[0026] (2)将步骤⑴获得的RNA逆转录成cDNA ;
[0027] (3)在荧光实时定量PCR仪上将DNAH5基因和管家基因进行扩增检测；
[0028] (4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，Δ Λ CT法进行相对定量；
[0029] (5) DNAH5基因表达下调，表明研宄对象为结肠癌患者。
[0030] 本发明的优点和有益效果在于：（1)本发明首次公开了 DNAH5基因与结肠癌相关 性，可以以DNAH5基因为基础在制备诊断试剂盒方面提供依据。（2)该发明提供的诊断试 剂盒可以通过检测基因表达情况诊断结肠癌的存在与否，利用该试剂盒检测结肠癌更加灵 敏，有利于疾病早期的诊断。
【附图说明】：
[0031] 图1表示荧光实时定量PCR测定在正常组织和结肠癌组织中DNAH5基因 mRNA的 相对表达量。
[0032] 具体的实施方式：
[0033] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，以下所述实施例中所使用的实验方法 如无特殊说明，均为常规方法。以下所