, SEQ ID N0.5:(Kub-3DR) 5’ -AGTGCAAGTCTGGGTTGCAGCCAACA-3’。
[0019]取仔猪腹泻肠组织，研磨稀释后，按照Trizol提取RNA的方法提取组织的RNA，然后使用TaKaRa公司一步法RT-PCR试剂盒Prime Script One Step RT-PCR Kit，操作如下:
以RNA提取物为模板进行RT-PCR扩增配制25 μ I体系，
2X1 step Buffer (含 dNTP)13 μ L
PrimeScript I Step Enzyme Mix IuL 上游引物(Kub-3DF)0.5μ L
下游引物(Kub-3DR)0.5μ L
RNA提取物(模版)IyL
RNase Free dH209 μ L
混匀、低速离心后置PCR自动扩增仪中，按照如下程序扩增:50°C 30min,94°C 2min —个循环一94°C 30sec，52°C 30sec，72°C 45sec 35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，利用T4连接酶与pMD-20-T Vector 16°C过夜连接，转化DH5 α感受态细胞，挑单克隆斑于LB(Amp+)中扩大培养,用质粒提取试剂盒提纯质粒pMD-Kobu_3D,通过SpeV/EcoRi酶切鉴定，确定阳性质粒，见附图1。再通过测序鉴定，将成功构建的阳性质粒pMD-Kobu-3D大量提取后用EcoRi单酶切将其线性化，
(2)体外转录获得标准品RNA
以上述线性化的质粒为模板，利用体外反转录试剂盒获得目的RNA。反应体系为:10XT7 RNA polymerase buffer 2 μ L, DTT2 μ L, DNTP Mixture 4 μ L, RNase inhibitor0.5 μ L, Template DNA 0.5 μ g, Τ7 RNA polymerase I μ L, DEPC H2O to 20 μ L,反应条件:37°C Ih后，按照RNA的提取和纯化步骤最后得到适量DEPC水溶解的RNA，测定浓度后于-80°C 冻存。利用公式:(copies/μ L) = [(ng 数 X 10_9) X (6.02 X 123) ] +(碱基数X 340)换算出目的RNA的拷贝数。
[0020]3.标准曲线的建立
根据定量后得到的拷贝数，将标准样品制成等6个梯度稀释的检测标准品，为降低误差，提高实验的可重复性，每个稀释度样品都设有三个重复孔，确定Ct值(Ct即cyclethreshold，指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时的所经历的循环数)，从而确定扩增效果最好的标准曲线。
[0021](I)荧光定量PCR扩增
扩增体系为 25μ L，其中包含 2X0ne Step RT-PCR Buffer III (含 dNTP Mixture,Mg2+)、TaKaRa Ex Taq HS (5U/μ L)、PrimeScript RT Enzyme Mix II>RNase Free dH20、上游引物SEQ ID N0.1、下游引物SEQ ID N0.2
探针SEQ ID N0.3、和稀释好的标准品2 μ L。
[0022]PCR 扩增采用 Agilent Techologies_Mx3005pPCR 扩增仪，程序为:42 °C 5min,95°C 1sec, I个循环(反转录)
950C 1sec, 55°C 30sec，72°C 30sec，40 个循环(PCR 扩增)
其中荧光信号收集设置在每一循环的72°C 30sec末。
[0023]PCR 扩增采用 Agilent Techologies_Mx3005pPCR 扩增仪，程序为:42 °C 5min,95°C 1sec, I个循环(反转录)
950C 1sec, 55°C 30sec，72°C 30sec，40 个循环(PCR 扩增)
其中荧光信号收集设置在每一循环的72°C 30sec末。
[0024]( 2 )标准曲线的制备
PCR荧光信号的分析采用安捷伦公司MxP1软件，所得到的荧光定量PCR扩增曲线以及相应的标准曲线分别见附图2、3。
[0025]4.特异性的检测
用下属猪常见疫病病原:猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎、猪蓝儿病毒、猪伪狂犬病毒和猪口蹄疫病毒，检测已建立方法的特异性，所得到的荧光定量PCR结果见附图4。结果显示该方法只能特异性的扩增出猪库博病毒RNA阳性对照，特异性好。
[0026]5.敏感性的检测
将标准样品制成I X 17-1 X 10° (copies/μ L) 8个稀释度，检测已建立方法的敏感性，所得到的荧光定量PCR结果见附图5。为确保检测的准确性，设置高压灭菌水为本底值对照，将< 34个循环的起峰的样品判定为阳性，此荧光定量检测方法能准确检测到10个拷贝的病原，而普通PCR智能检测到I X 14个拷贝，由此可见本发明的荧光定量PCR的检测敏感性是普通PCR的13倍，敏感性好。
【主权项】
1.一种用于检测猪库博病毒的的引物对，其特征在于所述的引物对序列为:SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.2。
2.一种用于检测猪库博病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于试剂盒中包括:序列分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的引物对；探针序列SEQ ID N0.3。
3.根据权利要求2所述的用于检测猪库博病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于试剂盒中还有:2XOne Step RT-PCR Buffer II1、TaKaRa Ex Taq HS、PrimeScript RTEnzyme Mix II，不含猪库博病毒的RNA样品和作为阳性对照的含有猪库博病毒的RNA样品。
4.使用权利要求2或3所述的用于检测猪库博病毒的实时荧光定量PCR试剂盒时PCR条件为:42°C 15min,95°C lOsec，I 个循环—95°C 10sec,55°C 30sec,72°C 30sec，40 个循环，其中突光信号收集放置在每个循环的72°C 30sec末端。
【专利摘要】本发明公开一种用于猪库博病毒检测的特异性引物对及探针，以及包括有特异性引物对及探针的实时定量检测试剂盒，本发明的两条特异性引物对是SEQ1和SEQ2及探针SEQ3。采用本发明的引物对或试剂盒可进行猪库博病毒检测，并可简化操作步骤，大大缩短了检测时间、减少了污染率，并提高了检测的准确度。荧光定量PCR检测法可直接通过标准曲线定量起始样品病毒拷贝数，同时其操作简单快捷，非常适用于田间样品流行病学调查的应用。
【IPC分类】C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104611463
【申请号】CN201510025403
【发明人】郑海学, 曹伟军, 郭建宏, 朱紫祥, 杨帆, 靳野
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月19日