一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组及其应用，属于动物源 成分特异性检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 蓝狐也称北极狐，是属于犬科、北极狐属的毛皮动物，在我国作为特种养殖动物已 有几十年的历史。蓝狐皮张性能优良，深受裘皮市场的青睐。近年来，蓝狐的毛皮制品市 场需求量很大，养殖数量也不断扩大。貉属于犬科貉属动物，皮张作为主要的产品，冬季取 皮后，蓝狐肉和貉肉经常被应用到动物饲料甚至是食品中。目前我国畜牧业行业中针对于 毛皮动物肉的检验检疫相关管理规定仍处于空白阶段，对于毛皮动物肉营养价值的研宄很 少，并且人们对于食用毛皮动物肉存在认识上的误区，有些地区受到风俗习惯的影响，从心 理上很难接受毛皮动物肉制品。
[0003] 近年来，羊肉卷市场比较混乱，很多压制的羊肉卷中掺杂着水貂肉、狐狸肉、貉子 肉以及其他肉类，从感官上难以去分辨，也曾有调查发现，因为貉和犬都属于犬科动物，貉 肉有被冒充为狗肉的现象，为了能快速、特异性检测出肉制品或者饲料中的貉的成分，有必 要开发出一种基于分子水平貉源性成分的检测方法，为检验检疫部门或者消费者提供便利 的技术服务，并且要求方法简便易于操作，检测成本低廉。
[0004] 目前，国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研宄报道，国内对牛、绵羊、猪、 鸡、驴、马、鹿属、狮、虎、豹等源性成分鉴定进行了研宄报道。但是，在用分子生物学方法鉴 定检测动物源性成分的研宄上，对蓝狐、貉源性成分鉴别检测的研宄很少，尤其是缺乏能够 同时、有效检测和区分犬科动物成分的方法。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组，采 取的技术方案如下：
[0006] 本发明的目的在于提供一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组，该引物组 种蓝狐物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示；所述貉物种成分引 物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示；所述犬物种成分引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6 所示。
[0007] 所述蓝狐物种扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；所述貉物种成分扩增 产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述犬物种成分扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0008] 所述引物组用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物组同时检测蓝狐、貉和犬物种成分 的方法，该方法是通过提取待测样品DNA，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示蓝狐特异性 引物对序列、SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示貉特异性引物对序列、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示犬特异性引物对序列为引物，进行PCR扩增，最后对扩增产物进行电泳检测和 /或序列分析。
[0010] 优选地，所述待测样品DNA为线粒体基因组DNA。
[0011] 所述方法中所述蓝狐特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；所 述貉特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述犬特异性引物，扩增目 标的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0012] 所述PCR扩增，反应体系为50 yL :DNA模板3 yL ;上游引物和下游引物各I. 0 yL ; rtaq mix 2x酶25yL，纯水25yL;PCR反应程序为：预变性：94°C，3min;进入循环：94°C变 性60s，58°C退火60s，72°C延伸60s，35次循环；终止延伸：72°C，7min ;4°C保存反应产物。
[0013] 所述方法应用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种含有所述引物组的试剂盒，该试剂盒包括 10XPCR缓冲液、lOumol/L蓝狐物种成分正向引物、lOumol/L蓝狐物种成分反向引物、 lOumol/L絡物种成分正向引物、lOumol/L絡物种成分反向引物、lOumol/L犬物种成分正向 引物、lOumol/L犬物种成分反向引物、lOumol/L dNTP和5U/uLTaqDNA聚合酶；其中，蓝狐物 种成分引物的正向引物如SEQ ID NO. 1所示，蓝狐物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO. 2 所示，貉物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO. 3所示，貉物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO. 4所示，犬物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO. 5所示，犬物种成分引物的反向引 物如SEQ ID NO. 6所示。
[0015] 所述试剂盒用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。
[0016] 本发明针对线粒体基因组序列进行分析比对，从NCBI查找与蓝狐同属不同种的 其他动物的线粒体基因组，获得遗传物质DNA信息序列，利用软件Clustal X进行序列比 对，寻找蓝狐的特异性片段序列，在此基础上设计引物，目标是该引物只能扩增出蓝狐的特 异性条带，不能扩增出其他动物的成分，利用电泳图谱比对，从而将蓝狐成分检测出来。从 蓝狐肝脏组织中提取线粒体基因组，利用设计好的引物，摸索适宜的PCR反应条件，检测结 果用电泳验证，同时将扩增条带进行测序分析，与已知相近物种序列进行比对来验证扩增 条带的正确性。应用相同方法，设计了貉特异性引物和犬特异性引物。并且权衡比较引物 扩增序列的大小，选取蓝狐的扩增序列如SEQ ID NO. 7所示，貉的扩增序列如SEQ ID NO. 8 所示，犬的扩增序列如SEQ ID NO. 9所示，便于在电泳图片中清晰地区分开来。PCR特异扩 增产物进行测序分析，获得序列信息。
[0017] 本发明取得的有益效果如下：
[0018] 本发明所采用的方法，与其他涉及到方法相比较，具有以下3个显著特点：一是快 速，从提取基因组到PCR扩增检验，历时1. 5?2. 0小时；较其他实时定量PCR以及蛋白质 电泳等方法，时间上节约一倍以上。二是高度特异性，经实验反复验证，PCR反应体系中特异 性引物只能扩增出目标物种条带，且清晰易于分辨；相比较传统感官判定，以及其他方法， 特异性高是本发明的一大优势；三是灵敏性，本发明涉及到的方法，模板基因组DNA检出限 为0. 05mg/mL，能够用于小样本测试检验。
[0019] 此外，本发明所提供的方法实现了在同一反应体系中快速同时检测蓝狐、貉和犬 物种成分，从而解决了实际中针对肉制品以及饲料等涉及到犬科动物成分的鉴定。该发明 成果的应用能够为毛皮动物附属产品生产领域以及质量检测监督部门提供有效的甄别手 段，且具有时效性高、成本低廉等特点。具有很好的潜在经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0020] 图1为同时检测蓝狐、貉和犬的多重PCR电泳图；
[0021] (M为Marker2000 ;条带1、2、3为貉和犬双重PCR条带；条带4为蓝狐、貉和犬三重 PCR条带）。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0023] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中常规材 料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0024] 实施例1动物蓝狐、貉和犬线粒体基因组DNA的提取及引物设计
[0025] 分别取3种动物肌肉组织200mg，采用线粒体基因组DNA提取试剂盒，北京百浩生 物科技有限公司购买。提取的DNA溶解于TE缓冲液中，保存于-20度备用。
[0026] L样本处理
[0027] a.组织匀浆：称取100?200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲 洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入I. OmL冰预冷的 细胞裂解液，(TC冰浴上下研磨组织20次；
[0028] 2.将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4°C，IOOOXg离心5min ;
[0029] 3.取上清，加入一新的离心管中，4°C，IOOOXg再次离心5min。
[0030] 4.取上清，加入一新的离心管中，4°C，12, OOOXg离心lOmin。离心后的上清含胞 浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；
[0031] 5.在线粒体沉淀中加入0. 5mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4°C，IOOOXg离心 5min ；
[0032] 6.取上清，加入一新的离心管中，4°C，12, 000Xg离心lOmin。弃上清，高纯度的线 粒体沉淀在管底；
[0033] 7.加入IOOul DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入IOul DNASE I溶 液（见准备工作），混匀，37°C水浴lOmin。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4°C， 12, 000 X g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200ul TE重悬线粒体沉淀，4°C，12, 000 X g 离心5min，洗去残留的DNA酶。
[0034] 8.得到的沉淀，用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入IOul RNase A。加入 200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置l-2min，再加入150ul