蛋白沉淀液，迅速 混勾。4°C，12, OOOXg离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
[0035] 9.取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚 氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说， 此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不 影响后续实验），加入〇. 6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2. 5倍体积的乙醇沉淀 DNA，如离心管太满可分两管）及5-10ul核酸核酸助沉剂，混匀，-20°C沉淀半小时左右（此 步可省），4°C，12, OOOXg 离心 IOmin。
[0036] 10.弃上清，再加入1111170%乙醇清洗，4<€，12,000\8离心5111；[11。重复用70%乙 醇洗一次。
[0037] 11.弃上清，再次离心Imin吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-105min。
[0038] 12.加入20-30ul TE缓冲液，轻弹管底，37°C水浴5分钟，线粒体DNA溶解。
[0039] 13.进行DNA电泳检测及-20°C保存，进行下步的实验。
[0040] 从公共数据库Genbank中下载已经登录的犬科动物相关的的线粒体基因组序列， 利用CLUSTAL软件进行比对分析，查找序列中特异的核苷酸位点，分别针对3种动物设计相 应的引物，目的是扩增出每一种动物的特异性条带。同时兼顾3种物种你扩增目的条带片 段大小相差100_200bp，便于电泳检测条带错开，肉眼观察即可区分。因此分别设计并且筛 选了特异性强的3对引物，如核苷酸序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 6所示。
[0041] 实施例2 :PCR扩增及扩增产物鉴定
[0042] 将提取好的蓝狐、貉和犬科动物线粒体基因组DNA进行PCR扩增；
[0043] PCR检测的反应体系为50 μ L :提取的样品DNA模板3 μ L ;所述的上游引物和下游 引物各 1. 〇 μ L ;rtaq mix 2χ 酶 25 μ L，纯水 25 μ L。
[0044] PCR反应程序为：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性60s，58°C退火60s， 72°C延伸60s，35次循环；终止延伸：72°C，7min ;4°C保存反应产物。
[0045] PCR产物电泳检测及产物序列分析：将PCR产物于1. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳， 15分钟后，凝胶成像系统观察，通过物种特异性条带大小，即可初步区分鉴定犬科3种动 物。
[0046] 扩增条带核苷酸序列分析：将每一个物种特异性扩增电泳条带回收，进行序列测 定分析，所得序列信息与Genbank登录已有相近物种序列信息进行序列比对，进一步从分 子水平鉴定所获得实验结果即是针对目标物种的特异性条带。
[0047] 实施例3肉制品中同时检测蓝狐、貉和犬物种成分
[0048] 市场购买羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉、狗肉；实验站采集毛皮动物蓝狐、貉的肌肉样本。 提取各个样本线粒体基因组，电泳检测。并且用分光广度计和核酸分析仪检测浓度和纯度。 符合要求的样品进行冷冻保存，做后续实验用。
[0049] 1、单一 PCR 检测
[0050] 将所获得的模板DNA，分别单一的加入3种动物中的任何一对引物，其结果为：羊 肉、牛肉、猪肉、鸡肉模板对于任何引物对均未能扩增出特异性条带。蓝狐、貉和犬均针对自 我物种的引物出现特异性条带，而蓝狐和貉的引物未能在犬中获得特异条带。因此，所述的 蓝狐、貉和犬特异引物对均具有本物种的特异性，而在其他涉及到的物种中不具备扩增条 件。
[0051] 2、3 重 PCR 检测。
[0052] 将蓝狐、貉和犬线粒体基因组等量混合，按照上述反应体系和条件，在同一体系中 同时加入上述3对引物。结果表明，在上述反应条件下，同一体系中能够分别扩增3个特异 条带（如图1所示），即针对蓝狐、貉和犬。PCR检测的反应体系为50 μ L :提取的样品DNA 模板3 yL ;所述的上游引物和下游引物各I. 0 yL ;rtaq mix 2χ酶25 yL，纯水25 yL。
[0053] PCR反应程序为：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性60s，58°C退火60s， 72°C延伸60s，35次循环；终止延伸：72°C，7min ;4°C保存反应产物。
[0054] 实施例4饲料中同时检测蓝狐、貉和犬物种成分
[0055] 提取饲料样品中线粒体基因组DNA，提取方法同上述，使用试剂盒方法。提取之后 后续的单一 PCR检测和多重PCR检测参照实施例3。
[0056] 将实验所涉及到的模板DNA混合后进行逐级稀释，稀释倍数分别为50 %，20 %， 10%，1%，0. 5%和0. 1%。分别用稀释的模板使用相同的体系和条件进行PCR扩增，结果表 明，模板稀释倍数为〇. 5 %时，依然可以明显扩增出条带，此时浓度为0. 05mg/mL。
[0057] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组，其特征在于，所述蓝狐物种成分引 物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 2所示；所述貉物种成分引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示；所述犬物种成分引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6 所示。
2. 权利要求1所述引物组，其特征在于，所述蓝狐物种扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；所述貉物种成分扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述犬物种成 分扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
3. 权利要求1所述引物组用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检 测。
4. 一种利用权利要求1所述引物组同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的方法，其特征在 于，通过提取待测样品DNA，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示蓝狐特异性引物对序列、 SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示貉特异性引物对序列、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所 示犬特异性引物对序列为引物，进行PCR扩增，最后对扩增产物进行电泳检测和/或序列分 析。
5. 权利要求4所述方法，其特征在于，所述待测样品DNA为线粒体基因组DNA。
6. 权利要求4所述方法，其特征在于，所述蓝狐特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7所示；所述貉特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述 犬特异性引物，扩增目标的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
7. 权利要求4所述方法，其特征在于，所述PCR扩增，反应体系为50 yL :DNA模板3 yL ; 上游引物和下游引物各1.0uL;rtaq mix 2x酶25yL，纯水25yL;PCR反应程序为：预变 性：94°0,31^11;进入循环 ：941：变性6〇8,581：退火6〇8,721：延伸6〇8,35次循环；终止延 伸：72°C，7min ;4°C保存反应产物。
8. 权利要求4所述方法用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测。
9. 一种含有权利要求1所述引物组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10 XPCR缓 冲液、10umol/L蓝狐物种成分正向引物、10umol/L蓝狐物种成分反向引物、10umol/L貉物 种成分正向引物、l〇umol/L絡物种成分反向引物、10umol/L犬物种成分正向引物、lOumol/ L犬物种成分反向引物、10um 〇l/L dNTP和5U/uLTaqDNA聚合酶；其中，蓝狐物种成分引物的 正向引物如SEQ ID NO. 1所示，蓝狐物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO. 2所示，貉物种 成分引物的正向引物如SEQ ID NO. 3所示，貉物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO. 4所 示，犬物种成分引物的正向引物如SEQ ID NO. 5所示，犬物种成分引物的反向引物如SEQ ID NO. 6所示。
10. 权利要求9所述试剂盒用于肉制品、饲料和毛皮产品中蓝狐、貉和犬物种成分的检 测。
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的引物组及其应用，属于动物源成分特异性检测技术领域。本发明所提供的引物组包括一对蓝狐物种成分检测引物、一对貉物种成分检测引物和一对犬物种成分检测引物，利用本发明所提供的引物组可以同时检测蓝狐、貉和犬物种成分。同时本发明还提供了一种利用引物组进行同时检测蓝狐、貉和犬物种成分的方法以及含有引物组的试剂盒。本发明所提供的方法具有较高的特异性和敏感性、简单可靠、快速安全的特点，适用于肉制品、饲料和皮毛制品中蓝狐、貉和犬物种成分的检测和鉴定。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104611454
【申请号】CN201510092831
【发明人】孙伟丽, 李光玉, 钟伟, 王卓, 杨雅涵
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年3月2日