专利名称：蓝狐细小病毒分离株bfpv-ta以及该病毒vp1、vp2、ns1基因全序列标准样品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，以及该病毒VP1、VP2、NSl三个基因全序列。
背景技术：
蓝狐细小病毒(Blue parvovirus, BFPV)是影响养狐业健康发展的重要疫病之一，是细小病毒科细小病毒属成员，以出血性肠炎、白细胞减少为主要临床特征，在幼狐可引起心肌炎，并且可引起狐狸繁殖障碍性疾病。BFPV与犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)以及猫细小病毒(Feline parvovirus，FPV)亲源关系很密切，核酸同源性在98%以上。 BFPV基因组是单链线型DNA，长约51Λ，有两个ORF，ORFl编码非结构蛋白(NSl蛋白，NS2 蛋白)，NS1蛋白是最主要的非结构蛋白，NSl蛋白对BFPV的复制具有重要的调节作用，NSl 蛋白还可以抑制细胞DNA复制，抑制多种异源启动子，可对转化细胞有直接毒性作用，从而在抑制肿瘤方面也起着重要作用。0RF2编码衣壳蛋白(VPl蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白)。疫苗接种是预防BFPV的有效措施，但是在实际生产中，仍然有许多BFPV感染的病例出现，我们从疑似BFPV感染的蓝狐粪便中分离到一株BFPV，并对其VPl全基因进行了序列分析。该研究为更为有效的制备病毒感染的快速诊断试剂和疫苗研究提供了实验数据。
发明内容
本发明涉及蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，以及该病毒VP1、VP2、NSl三个基因全序列。本发明蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，VPl氨基酸序列为 MAPPAKRARRGLVPPGYKYLGPGNSLDQGEPTNPSDAAAKEHDEAYAAYLRSGKNPYLYFSPADQRFIDQTK
DATDWGGKIGHYFFRAKKAIAPVLTDTPDHPSTSRPTKPTKRSKPPPHIFINLAKKKKAGAGQVKRDNLAPMSDGAV QPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEFKFLENGWVEITANSSRLVHLNMPESENYKRVV VNNMDKTAVKGNMALDDIHVQIVTPWSLVDANAWGVWFNP⑶WQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNWLKTVSESATQP PTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQWDRTLVPSHTGTSGTPTNIYHGTD PDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQSEGPTNFGDIGVQQDKRR GVTQMGNTDYITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAFGRQHGQKTTTT GETPERFTYIAHQDTGRYPAGDWIQNINFNLPVTNDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTALNNVPPVYPNGQ IWDKEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASA匪SRIVTYSDFffffKGKLVFKAKLRASHTW NPIQQMSINVDNQFNYLPNNIGAMKIVYEKSQLAPRKLY。本发明蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，VP2氨基酸序列为 MSDGAVQPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEFKFLENGffVEITANSSRLVHLN
MPESENYKRVVVNNMDKTAVKGNMALDDIHVQIVTPWSLVDANAWGVffFNPGDffQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNVV LKTVSESATQPPTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQWDRTLVPSHTGTSGTPTNIYHGTDPDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQSEGPTNF ⑶IGVQQDKRRGVTQMGNTDYITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAF GRQHGQKTTTTGETPERFTYIAHQDTGRYPA⑶WIQNINFNLPVTNDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTAL NNVPPVYPNGQIWDKEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASA匪SRIVTYSDFffffKGKLV FKAKLRASHTWNPIQQMSINVDNQFNYLPNNIGAMKIVYEKSQLAPRKLY。本发明蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，NSl氨基酸序列为
MMLQPDSYIEMMAQPGGENLLKNTLEICTLTLARTKTAFELILEKANNTKLTNFDLANSRTCQIFRMHGffNW IKVCHAIACVLNRQGGKRNTVLFHGPASTGKSIVAQAIAQAVGNVGCYNAANVNFPFNDCTNKNLIWIEEAGNFGQQ VNQFKAICSGQTIRIDQKGKGSKQIEPTPVIMTTNENITIVRIGCEERPEHTQPIRDRMLNIKLVCKLP⑶FGLVDK EEWPLICAWLVKHGYESTMANYTHHWGKVPEWDENWAEPKIQEGVNSPGCKDLETQAASNPQSQDQVLTPLTPDVVD LALEPWSTPVTPIAETANQQSNQLGVTHKDVQASPTWSEIEADLRAIFTSEQLEEDFRDDLD。本发明蓝狐细小病毒VP1、VP2基因全序列，其核苷酸序列为
atggcacctc cggcaaagag agccaggaga ggtaagggtg tgttagtaaa gtggggggag
gggaaaaatt ttgggcctgg cgaagcttac tttatagatc aagcaattgc aagaagtaaa aaaagagaca atgaaagagc ttctacgggt aactcaagca tggataaaac attggttgat agtgagttgc ctactcagcc taatactatg ataccaactc gcacaccaac gccagtacac agactaacac ctgaaggacc aaatacagac tcttttgaag atgaaaatca aacaggagaa tggattcaaa gaggtaaaac
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3. C C 3.3. C 3.3.3.
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3.3. C C 3.3. C 3.3.
taaaaaccca tgggggggga cagatcatcc caatcttgca ggagcagttc ctggaggcgg atttaaattt ccagaaagtg ctttagatga gtttaatcca gaaattttta atgatttaac gagatctgag tgggatagaa atccagatga atttgctaca gcattgggct gagttcaaca tatgagacca aaaacaccta gatatgcatt tatagcacat gtaacaaatg tatttaatac
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gcctccaggt gccgctgcaa tctcgccagc ttattttttt agaccaacaa aagccggtgc tggtcaacct ggttctgggg gatgggtgga aagagtagtt caaattgtaa aactaattgt aaagactgtt atggttgcat tttatccatg atctcatact tatactattg tttttgattg tctaaattct cgtggtgtaa gttatagtgc acggggggga catggtcaaa gaagatatcc gctaccaaca ttaactgcat
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aggacaagta gctgtcagaa gtgtggggat aatcacagca gtaaataata caccttggtc taatactatg tcagaatctg tagatagtaa gaaaccaacc ggaactagtg aaaattctgt taaaccatgt ttgcctcaat ctcaaatggg accatattat gcgcaaacag
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agcaggagat gatccaattg taaataatgtaccaccagtt tatccaaatg gtcaaatttg ggataaagaa tttgatactg acttaaaacc aagacttcat gtaaatgcac catttgtttg tcaaaataat tgtcctggtc aattatttgt aaaagttgcg cctaatttaa caaatgaata tgatcctgat gcatctgcta atatgtcaag aattgtaact tactcagatt tttggtggaa aggtaaatta gtatttaaag ctaaactaag agcatctcat acttggaatc caattcaaca aatgagtatt aatgtagata accaatttaa ctatctacca aataatattg gagctatgaa aattgtatat gaaaaatctc aactagcacc tagaaaatta tattaaD本发明蓝狐细小病毒NSl基因全序列，其核苷酸序列为
ccatgtctggcaaccagtatactgaggaagttatggagggagtaaattggttaaagaaacatgcagaaaatg
aagcattttcgtttgtttttaaatgtgacaacgtccaactaaatggaaaggatgttcactggaacaactataccaaa ccaattcaaaatgaagagctaacatctttaattagaggagcacaaacagcaatggaccaaaccgaagaagaagaaat ggactgggaatcggaagttgatagtctcgccaaaaagcaagtacaaacttttgatgcattaattaaaaaatgtcttt ttgaagtctttgtttctaaaaatatagaaccaaatgaatgtgtttggtttattcaacatgaatggggaaaagatcaa ggctggcattgtcatgttttactttatagtaagaacttacaacaagcaactggtaaatggctacgcagacaaatgaa tatgtattggagtagatggttggtgactctttgttcggtaaacttaacaccaactgaaaggattaagctcagagaaa ttgaagaagatagtgaatgggtgactatattaacatacagacataagcaaacaaaaaaagactatgttaaaatggtt cattttggaaatatgatagcatattactttttaacaaagaaaaaaattgtccacatgacaaaagaaagtggctattt tttaagtactgattctggttggaaatttaactttatgaagtatcaagacagacatactgtcagcacactttacactg aacaaatgaaaccagaaaccgttgaaaccacagtgacgacagcacaggaaacaaagcgcgggagaattcaaactaaa aaggaagtgtcaatcaaatgtactttgcgggacttggttagtaaaagagtaacatcacctgaagactggatgatgtt acaaccagatagttatattgaaatgatggcacaaccaggaggtgaaaatcttttaaaaaatacacttgaaatttgta ctttgactttagcaagaacaaaaacagcatttgaattaatacttgaaaaagcaaataatactaaactaactaacttt gatcttgcaaattctagaacatgtcaaatttttagaatgcacggatggaattggattaaagtttgtcacgctatagc atgtgttttaaatagacaaggtggtaaaagaaatacagttctttttcatggaccagcaagtacaggaaaatctattg ttgctcaagccatagcacaagctgtgggtaatgttggttgttataatgcagcaaatgtaaattttccatttaatgac tgtaccaataaaaatttaatttggattgaagaagctggtaactttggtcaacaagttaatcagtttaaagcaatttg ttctggacaaacaattagaattgatcaaaaaggtaaaggaagtaagcaaattgaaccaactccagtaattatgacaa ctaatgaaaatataacaattgtaagaattggatgtgaagaaagacctgaacatacacaaccaataagagacagaatg ctgaacattaagttagtatgtaagcttccaggagactttggtttggttgataaagaagaatggcctttaatatgtgc atggttagttaaacatggttatgaatcaaccatggctaactatacacatcattggggaaaagtaccagaatgggatg aaaactgggcggagcctaaaatacaagaaggtgtaaattcaccaggttgcaaagacttagagacacaagcggcaagc aatcctcagagtcaagaccaagttctaactcctctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccgtggagtac tccagttacgcccattgcagaaactgcaaatcaacaatcaaaccaacttggcgttactcacaaagacgtgcaagcga gtccgacatggtccgaaatagaggcagacctaagagccatctttacttctgaacaattggaagaagattttcgagac gBcttgg^tt已已ggt&cg&tg已已tctct^gBgg已tccccgggt已ccg^gctcg已已ttcgt已已tc^ttο本发明蓝狐细小病毒制备方法 (1)样品与处理
样品为2006-2007年泰安郊区蓝狐养殖场送检的疑是BFPV感染的蓝狐的5份粪便，粪便样品用D-MEM细胞营养液制成1 9悬液，混勻，4000r/min离心25min，取上清，经0. 22Mm 微孔滤膜过滤除菌。将处理好的样品置_20°C保存，待分离鉴定。
(2)病毒分离
将处理好的样品按培养液体积的1/20 - 1/30同步接种刚消化分种的F81细胞，置 37°C静止培养。每天观察细胞的贴壁生长和细胞病变(CPE)情况。如无CPE，则继续按常规细胞传代进行培养。如出现CPE，则按培养液的1/10接种F81细胞进行扩大培养至第5代， 冻融三次，收毒，置-20°C保存，待鉴定。如传至第5代仍无CPE，则视为分离阴性，将分离获得的病毒命名为BFPV-TA。本发明BFPV VP1、VP2、NS基因的克隆与序列分析
根据Genbank上发表的CPV、MEV与FPV基因序列，利用DNAstar软件分别设计扩增BFPV VPl基因的引物，
上游引物5~-CGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACC-3~， 下游引物5:CTAGGTGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3~。VP2基因的引物，
上游引物5:CATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3~， 下游引物5:CTAGGTGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3~。BFPV NSl基因的引物，
上游引物5~-CCATGTCTGGCAACCAGTATACTGAGG-3~， 下游引物5:CATCGTACCTTAATCCAAGTCGTCTCG-3、
PCR 体系5XPCR-buffer 5μ 1,2. 5mmol/L dNTP 5 μ 1，VPl 基因上、下游引物 (20ρ θ1/μ 1)各 1μ 1，BFPV 细胞培养物 2μ IJaq DNA polymerase 0· 5 μ 1，用 DEPC 水补充至50μ 1 ；
PCR反应参数96°C变性:3min，95°C预变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 150sec，进行30个循环，最后72°C再延伸IOmin。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；
将获得的BFPV-TA VPl基因片段克隆入pMDIS-T载体，转化宿主菌DH5ci ；获得重组子 pBFPV/TA-VPl ；用限制性内切酶对所获得的重组子进行酶切鉴定，筛选阳性克隆、测序。本发明属于微生物病毒领域，提供了蓝狐细小病毒，其核苷酸序列如说明书核苷酸序列表所示。本发明通过送检的疑是细小病毒感染的蓝狐粪便中分离分离培养和PCR鉴定，以及病毒的VP1、VP2、NSl 3个基因全序列测序比对，获得并证明所分离的病毒为蓝狐细小病毒毒株，命名为BFPV-TA。序列分析表明BFPV-TA VPl蛋白序列表现出了过渡型序列特征，介于FPV与CPV间的过度类型，VP2基因系统发生分析BFPV-TA与FPV的亲源关系较为密切，NSl基因系统发生分析，BFPV-TA成单独的分支，这说明狐狸有可能在CPV的起源过程起到重要的作用，本发明的毒株补充了我国蓝狐细小病毒的极有价值的遗传信息，对该病原引起感染监测体系的完善有重要作用，还可用于制备病毒感染的快速诊断试剂和疫苗研究。
图1正常的F81细胞图。图2接种BFPV-TA在F81细胞的CPE图。图3 BFPV-TA VPl基因PCR扩增结果图，其中1.阴性对照；2.目的条带2321bp ；3. DNA Marker DL2000 + 15000 ；
图4为重组子pBFPV-TA-VPl酶切鉴定结果图，其中
1.pBFPV/TA-VPl ρlasmid / EcoR V
2.pBFPV/TA-VPl plasmid / Bgl II
3.pBFPV/TA-VPl plasmid / Pst I
4.DNA Marker DL2000 + 15000 ；
图5 BFPV-TA VP2基因PCR扩增结果图，其中1.阴性对照；2.目的带；3. DL2000 ； 图6 BFPV-TA NSl基因PCR扩增结果图，其中1.目的带；2.阴性对照3. DL2000 ； 图7重组子pBFPV / TA - VP2酶切鉴定结果图，其中
1.pBFPV/TA-VP2 / Bgl II
2.pBFPV/TA-VP2/EcoR V
3.pBFPV/TA-VP2/Pst I
4.DL15000 + DL2000 ；
图8重组子pBFPV / TA - NSl酶切鉴定结果图，其中
1.pBFPV/TA-NSl /Xba I
2.pBFPV/TA-NSl/Hind III
3.pBFPV/TA-NSl/EcoR
4.DL15000 + DL2000。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。实施例1
蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，VPl氨基酸序列为
MAPPAKRARRGLVPPGYKYLGPGNSLDQGEPTNPSDAAAKEHDEAYAAYLRSGKNPYLYFSPADQRFIDQTK DATDWGGKIGHYFFRAKKAIAPVLTDTPDHPSTSRPTKPTKRSKPPPHIFINLAKKKKAGAGQVKRDNLAPMSDGAV QPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEFKFLENGWVEITANSSRLVHL匪PESENYKRW VNNMDKTAVKGNMALDDIHVQIVTPWSLVDANAWGVWFNP⑶WQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNWLKTVSESATQP PTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQWDRTLVPSHTGTSGTPTNIYHGTD PDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQSEGPTNF⑶IGVQQDKRR GVTQMGNTDYITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAAD⑶PRYAFGRQHGQKTTTT GETPERFTYIAHQDTGRYPA⑶WIQNINFNLPVTNDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTALNNVPPVYPNGQ IWDKEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASA匪SRIVTYSDFffffKGKLVFKAKLRASHTW NPIQQMSINVDNQFNYLPNNIGAMKIVYEKSQLAPRKLY。蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，VP2氨基酸序列为 MSDGAVQPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEFKFLENGffVEITANSSRLVHLN
MPESEOTKRVWNNMDKTAVKGNMALDDIHVQIVTPWSLVDANAWGVWFNP⑶WQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNVV LKTVSESATQPPTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQWDRTLVPSHTGTS GTPTNIYHGTDPDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQSEGPTNF⑶IGVQQDKRRGVTQMGNTDYITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAF GRQHGQKTTTTGETPERFTYIAHQDTGRYPAGDWIQNINFNLPVTNDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTAL NNVPPVYPNGQIWDKEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASA匪SRIVTYSDFffffKGKLV FKAKLRASHTWNPIQQMSINVDNQFNYLPNNIGAMKIVYEKSQLAPRKLY。蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，NSl氨基酸序列为 MMLQPDSYIEMMAQPGGENLLKNTLEICTLTLARTKTAFELILEKANNTKLTNFDLANSRTCQIFRMHGWNW
IKVCHAIACVLNRQGGKRNTVLFHGPASTGKSIVAQAIAQAVGNVGCYNAANVNFPFNDCTNKNLIWIEEAGNFGQQ VNQFKAICSGQTIRIDQKGKGSKQIEPTPVIMTTNENITIVRIGCEERPEHTQPIRDRMLNIKLVCKLP⑶FGLVDK EEWPLICAWLVKHGYESTMANYTHHWGKVPEWDENWAEPKIQEGVNSPGCKDLETQAASNPQSQDQVLTPLTPDVVD LALEPWSTPVTPIAETANQQSNQLGVTHKDVQASPTWSEIEADLRAIFTSEQLEEDFRDDLD。蓝狐细小病毒VPl、VP2基因全序列，其核苷酸序列为
atggcacctc cggcaaagag agccaggaga ggtaagggtg tgttagtaaa gtggggggag
gggaaaaatt ttgggcctgg cgaagcttac tttatagatc aagcaattgc aagaagtaaa aaaagagaca atgaaagagc ttctacgggt aactcaagca tggataaaac attggttgat agtgagttgc ctactcagcc taatactatg ataccaactc gcacaccaac gccagtacac agactaacac ctgaaggacc aaatacagac tcttttgaag atgaaaatca aacaggagaa tggattcaaa gaggtaaaac accaccagtt
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3. C C 3.3. C 3.3.3.
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3.3.3. 3. 3. 3.
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3.3. C C 3.3. C 3.3.
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agcaggagat gatccaattg taaataatgt aagacttcatgtaaatgcac catttgtttg tcaaaataat tgtcctggtc aattatttgt aaaagttgcg cctaatttaa caaatgaata tgatcctgat gcatctgcta atatgtcaag aattgtaact tactcagatt tttggtggaa aggtaaatta gtatttaaag ctaaactaag agcatctcat acttggaatc caattcaaca aatgagtatt aatgtagata accaatttaa ctatctacca aataatattg gagctatgaa aattgtatat gaaaaatctc aactagcacc tagaaaatta tattaaD蓝狐细小病毒NSl基因全序列，其核苷酸序列为
ccatgtctggcaaccagtatactgaggaagttatggagggagtaaattggttaaagaaacatgcagaaaatg
aagcattttcgtttgtttttaaatgtgacaacgtccaactaaatggaaaggatgttcactggaacaactataccaaa ccaattcaaaatgaagagctaacatctttaattagaggagcacaaacagcaatggaccaaaccgaagaagaagaaat ggactgggaatcggaagttgatagtctcgccaaaaagcaagtacaaacttttgatgcattaattaaaaaatgtcttt ttgaagtctttgtttctaaaaatatagaaccaaatgaatgtgtttggtttattcaacatgaatggggaaaagatcaa ggctggcattgtcatgttttactttatagtaagaacttacaacaagcaactggtaaatggctacgcagacaaatgaa tatgtattggagtagatggttggtgactctttgttcggtaaacttaacaccaactgaaaggattaagctcagagaaa ttgaagaagatagtgaatgggtgactatattaacatacagacataagcaaacaaaaaaagactatgttaaaatggtt cattttggaaatatgatagcatattactttttaacaaagaaaaaaattgtccacatgacaaaagaaagtggctattt tttaagtactgattctggttggaaatttaactttatgaagtatcaagacagacatactgtcagcacactttacactg aacaaatgaaaccagaaaccgttgaaaccacagtgacgacagcacaggaaacaaagcgcgggagaattcaaactaaa aaggaagtgtcaatcaaatgtactttgcgggacttggttagtaaaagagtaacatcacctgaagactggatgatgtt acaaccagatagttatattgaaatgatggcacaaccaggaggtgaaaatcttttaaaaaatacacttgaaatttgta ctttgactttagcaagaacaaaaacagcatttgaattaatacttgaaaaagcaaataatactaaactaactaacttt gatcttgcaaattctagaacatgtcaaatttttagaatgcacggatggaattggattaaagtttgtcacgctatagc atgtgttttaaatagacaaggtggtaaaagaaatacagttctttttcatggaccagcaagtacaggaaaatctattg ttgctcaagccatagcacaagctgtgggtaatgttggttgttataatgcagcaaatgtaaattttccatttaatgac tgtaccaataaaaatttaatttggattgaagaagctggtaactttggtcaacaagttaatcagtttaaagcaatttg ttctggacaaacaattagaattgatcaaaaaggtaaaggaagtaagcaaattgaaccaactccagtaattatgacaa ctaatgaaaatataacaattgtaagaattggatgtgaagaaagacctgaacatacacaaccaataagagacagaatg ctgaacattaagttagtatgtaagcttccaggagactttggtttggttgataaagaagaatggcctttaatatgtgc atggttagttaaacatggttatgaatcaaccatggctaactatacacatcattggggaaaagtaccagaatgggatg aaaactgggcggagcctaaaatacaagaaggtgtaaattcaccaggttgcaaagacttagagacacaagcggcaagc aatcctcagagtcaagaccaagttctaactcctctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccgtggagtac tccagttacgcccattgcagaaactgcaaatcaacaatcaaaccaacttggcgttactcacaaagacgtgcaagcga gtccgacatggtccgaaatagaggcagacctaagagccatctttacttctgaacaattggaagaagattttcgagac gBcttgg^tt已已ggt&cg&tg已已tctct^gBgg已tccccgggt已ccg^gctcg已已ttcgt已已tc^ttο实施例2
蓝狐细小病毒制备方法，按下述步骤进行制备 1样品与处理
样品为2006-2007年泰安郊区蓝狐养殖场送检的疑是BFPV感染的蓝狐的5份粪便，粪便样品用D-MEM细胞营养液制成1 : 9悬液，混勻，4000r/min离心25min，取上清，经0. 22Wn 微孔滤膜过滤除菌。将处理好的样品置_20°C保存，待分离鉴定。
2 病毒分离
将处理好的样品按培养液体积的1/20 - 1/30同步接种刚消化分种的F81细胞，置 37°C静止培养。每天观察细胞的贴壁生长和细胞病变(CPE)情况。如无CPE，则继续按常规细胞传代进行培养。如出现CPE，则按培养液的1/10接种F81细胞进行扩大培养至第5代， 冻融三次，收毒，置-20°C保存，待鉴定。如传至第5代仍无CPE，则视为分离阴性。将分离获得的病毒命名为BFPV-TA。3常规病毒学鉴定
3. 1病毒理化学特性试验
对待鉴定病毒进行理化学特征鉴定[3]。3. 2红细胞血凝谱试验
采用CPV的微量HA试验方法，分别用的猪、马、猫、豚鼠、鸡、兔和人的红细胞(其中猪红细胞稀释液含0. 5%的兔血清)进行HA试验，滴定待检病毒的HA效价。3. 3人工感染易感蓝狐试验
用BFPV-TA的第5代细胞培养物(HA效价均滴定稀释为1 256)对4(T45d的蓝狐(血清抗BFPV抗体HI效价均小于1:2)进行人工感染试验。接种途径为肌注:3ml，口服:3ml。将 6只幼龄蓝狐随机分为2组，每组3只。用BFPV-TA对第1组实验蓝狐进行接种；第2组为空白对照，接种生理盐水。对两组实验蓝狐进行隔离饲养。接种后，每天观察实验蓝狐的临床变化，每3d进行一次白细胞总数计数，自接种后4d开始收集粪便，进行BFPV HA/HI和PCR (同1. 3 PCR的引物及程序)检测。每隔1周检测一次血清的抗BFPV抗体的HI效价。攻毒后观察21d，如无眼观临床症状、白细胞总数正常、HI效价上升，则视为实验蓝狐健康。4 BFPV VP1、VP2、NS基因的克隆与序列分析
根据Genbank上发表的CPV、MEV与FPV基因序列，利用DNAstar软件分别设计扩增BFPV VPl基因的引物，
上游引物5~-CGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACC-3~， 下游引物5:CTAGGTGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3~。VP2基因的引物，
上游引物5:CATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3~， 下游引物5:CTAGGTGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3~。BFPV NS1基因的引物，
上游引物5~-CCATGTCTGGCAACCAGTATACTGAGG-3~， 下游引物5:CATCGTACCTTAATCCAAGTCGTCTCG-3、
PCR 体系5XPCR-buffer 5μ 1,2. 5mmol/L dNTP 5 μ 1，VPl 基因上、下游引物 (20ρ θ1/μ 1)各 1μ 1，BFPV 细胞培养物 2μ IJaq DNA polymerase 0· 5 μ 1，用 DEPC 水补充至50μ 1。PCR 反应参数96°C 变性 3min，95°C 预变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 150sec，进行30个循环，最后72°C再延伸IOmin。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。将获得的BFPV-TA VPl基因片段克隆入pMD18_T载体，转化宿主菌DH5 α。获得重组子pBFPV/TA-VPl。用限制性内切酶对所获得的重组子进行酶切鉴定，筛选阳性克隆、测序。
权利要求
1.蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，VPl氨基酸序列为MAPPAKRARRGLVPPGYKYLGPGNSLDQGEPTNPSDAAAKEHDEAYAAYLRSGKNPYLYFSPADQRFIDQTK DATDWGGKIGHYFFRAKKAIAPVLTDTPDHPSTSRPTKPTKRSKPPPHIFINLAKKKKAGAGQVKRDNLAPMSDGAV QPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEFKFLENGWVEITANSSRLVHL匪PESENYKRW VNNMDKTAVKGNMALDDIHVQIVTPWSLVDANAWGVWFNP⑶WQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNVVLKTVSESATQP PTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQffDRTLVPSHTGTSGTPTNIYHGTD PDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQSEGPTNF⑶IGVQQDKRR GVTQMGNTDYITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAFGRQHGQKTTTT GETPERFTYIAHQDTGRYPAGDWIQNINFNLPVTNDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTALNNVPPVYPNGQ IWDKEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASA匪SRIVTYSDFffffKGKLVFKAKLRASHTW NPIQQMSINVDNQFNYLPNNIGAMKIVYEKSQLAPRKLY。
2.蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，VP2氨基酸序列为MSDGAVQPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEFKFLENGffVEITANSSRLVHLN MPESEOTKRVWNNMDKTAVKGNMALDDIHVQIVTPWSLVDANAWGVWFNP⑶WQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNVV LKTVSESATQPPTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQWDRTLVPSHTGTS GTPTNIYHGTDPDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQSEGPTNF ⑶IGVQQDKRRGVTQMGNTDYITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAF GRQHGQKTTTTGETPERFTYIAHQDTGRYPAGDWIQNINFNLPVTNDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTAL NNVPPVYPNGQIWDKEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASA匪SRIVTYSDFffffKGKLV FKAKLRASHTWNPIQQMSINVDNQFNYLPNNIGAMKIVYEKSQLAPRKLY。
3.蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，NS1氨基酸序列为MMLQPDSYIEMMAQPGGENLLKNTLEICTLTLARTKTAFELILEKANNTKLTNFDLANSRTCQIFRMHGWNW IKVCHAIACVLNRQGGKRNTVLFHGPASTGKSIVAQAIAQAVGNVGCYNAANVNFPFNDCTNKNLIWIEEAGNFGQQ VNQFKAICSGQTIRIDQKGKGSKQIEPTPVIMTTNENITIVRIGCEERPEHTQPIRDRMLNIKLVCKLP⑶FGLVDK EEWPLICAWLVKHGYESTMANYTHHWGKVPEWDENWAEPKIQEGVNSPGCKDLETQAASNPQSQDQVLTPLTPDVVD LALEPWSTPVTPIAETANQQSNQLGVTHKDVQASPTWSEIEADLRAIFTSEQLEEDFRDDLD。
4.蓝狐细小病毒VP1、VP2基因全序列，其核苷酸序列为atggcacctc cggcaaagag agccaggaga ggtaagggtg tgttagtaaagtggggggaggggaaaaattactaagtatgtgtttttttataggacttgtgcctccaggtttgggcctgggaacagtcttgaccaaggag3.3. C C 3.3. C 3.3.cccttctgacgccgctgcaaaagaacacgacgaagcttacgctgcttatcttcgctctggtaaaaacccatacttatatttctcgccagcagatcaacgctttatagatcaaactaaggacgctacagattggggggggaaaataggacattatttttttagagctaaaaaagcaattgctccagtattaactgatacaccagatcatcc3. C 3.3. C 3. C 3.agaccaacaa3.3. C C 3.3. C 3.3.aagaagtaaaccaccacctcatattttcatcaatcttgcaaagccggtgcaggacaagtaaaaagagacaatcttgcaccaatgagtgatggagcagttcaaccagacggtggtcaacctgctgtcagaaatgaaagagctacaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatttctacgggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacggatgggtggaaatcacagcaaactcaagcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaagagtagttgtaaataatatggataaaactgcagttaaaggaaacatggctttagatgacattcatgtacaaattgtaacaccttggtcattggttgat agtgagttgc ctactcagcc taatactatg ataccaactc gcacaccaac gccagtacac agactaacac ctgaaggacc aaatacagac tcttttgaag atgaaaatca aacaggagaa tggattcaaa gaggtaaaac accaccagtt gtaaatgcac caaatgaata aggtaaatta aatgtagatagcaaatgctt atttagttag.3. C C 3.3. C 3.3.3.ccatttactc catggagata.3.3.3. 3. 3. 3. ttactaagaa atacatggca tactaacttt tatattactg cgtctacaca agcagcagat acacctgaga atattaactt aggaattaac tatccaaatg catttgtttg tgatcctgat gtatttaaag accaatttaaggggagtttg ttttgaacaa gtttataata cagcagctat ttattttcaa catggtacag caggtgatga aacaaataga ggtgatatag aagctactat agggccattt ggtgatccaa gatttacata taaccttcctgtcaaatttggcatctgcta ctaaactaag ctatctaccagtttaatcca gaaattttta atgatttaac gagatctgag tgggatagaa atccagatga atttgctaca gcattgggct gagttcaaca tatgagacca aaaacaccta gatatgcatt tatagcacat gtaacaaatg tatttaatac ggataaagaa tgtcctggtc atatgtcaag agcatctcat aataatattgggagattggc atgttgtttt tgcatcattg acattgggtt cattagtacc tgttcaattt ggaacatttt taccaccatt agataaaaga gctgaggttg ttgcagcagg tggtagacaa caagatacag ataatgtatt ttatggtcct tttgatactg aattatttgt aattgtaact acttggaatc gagctatgaaaactaattgt aaagactgtt atggttgcat tttatccatg atctcatact tatactattg tttttgattg tctaaattct cgtggtgtaa gttatagtgc acggggggga catggtcaaa gaagatatcc gctaccaaca ttaactgcat acttaaaacc aaaagttgcg tactcagatt caattcaaca aattgtatattaatactatg tcagaatctg tagatagtaa gaaaccaacc ggaactagtg aaaattctgt taaaccatgt ttgcctcaat ctcaaatggg accatattat gcgcaaacag.3.3.3. C 3. C 3. Cagcaggagat gatccaattg taaataatgt aagacttcat cctaatttaa tttggtggaa aatgagtatt gaaaaatctcaactagcacc tagaaaatta tattaaD
5.蓝狐细小病毒NSl基因全序列，其核苷酸序列为ccatgtctggcaaccagtatactgaggaagttatggagggagtaaattggttaaagaaacatgcagaaaatg aagcattttcgtttgtttttaaatgtgacaacgtccaactaaatggaaaggatgttcactggaacaactataccaaa ccaattcaaaatgaagagctaacatctttaattagaggagcacaaacagcaatggaccaaaccgaagaagaagaaat ggactgggaatcggaagttgatagtctcgccaaaaagcaagtacaaacttttgatgcattaattaaaaaatgtcttt ttgaagtctttgtttctaaaaatatagaaccaaatgaatgtgtttggtttattcaacatgaatggggaaaagatcaa ggctggcattgtcatgttttactttatagtaagaacttacaacaagcaactggtaaatggctacgcagacaaatgaa tatgtattggagtagatggttggtgactctttgttcggtaaacttaacaccaactgaaaggattaagctcagagaaa ttgaagaagatagtgaatgggtgactatattaacatacagacataagcaaacaaaaaaagactatgttaaaatggtt cattttggaaatatgatagcatattactttttaacaaagaaaaaaattgtccacatgacaaaagaaagtggctattt tttaagtactgattctggttggaaatttaactttatgaagtatcaagacagacatactgtcagcacactttacactg aacaaatgaaaccagaaaccgttgaaaccacagtgacgacagcacaggaaacaaagcgcgggagaattcaaactaaa aaggaagtgtcaatcaaatgtactttgcgggacttggttagtaaaagagtaacatcacctgaagactggatgatgtt acaaccagatagttatattgaaatgatggcacaaccaggaggtgaaaatcttttaaaaaatacacttgaaatttgta ctttgactttagcaagaacaaaaacagcatttgaattaatacttgaaaaagcaaataatactaaactaactaacttt gatcttgcaaattctagaacatgtcaaatttttagaatgcacggatggaattggattaaagtttgtcacgctatagc atgtgttttaaatagacaaggtggtaaaagaaatacagttctttttcatggaccagcaagtacaggaaaatctattg ttgctcaagccatagcacaagctgtgggtaatgttggttgttataatgcagcaaatgtaaattttccatttaatgactgtaccaataaaaatttaatttggattgaagaagctggtaactttggtcaacaagttaatcagtttaaagcaatttg ttctggacaaacaattagaattgatcaaaaaggtaaaggaagtaagcaaattgaaccaactccagtaattatgacaa ctaatgaaaatataacaattgtaagaattggatgtgaagaaagacctgaacatacacaaccaataagagacagaatg ctgaacattaagttagtatgtaagcttccaggagactttggtttggttgataaagaagaatggcctttaatatgtgc atggttagttaaacatggttatgaatcaaccatggctaactatacacatcattggggaaaagtaccagaatgggatg aaaactgggcggagcctaaaatacaagaaggtgtaaattcaccaggttgcaaagacttagagacacaagcggcaagc aatcctcagagtcaagaccaagttctaactcctctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccgtggagtac tccagttacgcccattgcagaaactgcaaatcaacaatcaaaccaacttggcgttactcacaaagacgtgcaagcga gtccgacatggtccgaaatagaggcagacctaagagccatctttacttctgaacaattggaagaagattttcgagac gBcttgg^tt已已ggt&cg&tg已已tctct^gBgg已tccccgggt已ccg^gctcg已已ttcgt已已tc^ttο
6.蓝狐细小病毒制备方法，其特征是，按下述步骤进行制备(1)病毒分离样品与处理样品为2006-2007年泰安郊区蓝狐养殖场送检的疑是BFPV感染的蓝狐的 5份粪便，粪便样品用D-MEM细胞营养液制成1 : 9悬液，混勻，4000r/min离心25min，取上清，经0. 22Mffl微孔滤膜过滤除菌，将处理好的样品置_20°C保存，待分离鉴定；(2)病毒分离将处理好的样品按培养液体积的1/20 - 1/30同步接种刚消化分种的F81细胞，置 37°C静止培养，每天观察细胞的贴壁生长和细胞病变(CPE)情况，如无CPE，则继续按常规细胞传代进行培养，如出现CPE，则按培养液的1/10接种F81细胞进行扩大培养至第5代， 冻融三次，收毒，置-20°C保存，待鉴定，如传至第5代仍无CPE，则视为分离阴性，将分离获得的病毒命名为BFPV-TA。
7.BFPV VP1、VP2、NS基因的克隆，其特征是，根据Genbank上发表的CPV、MEV与FPV基因序列，利用DNAstar软件分别设计扩增BFPVVPl基因的引物，上游引物5~-CGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACC-3~，下游引物5:CTAGGTGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3~ ；VP2基因的引物，上游引物5:CATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3~，下游引物5:CTAGGTGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3~ ；BFPV NSl基因的引物，上游引物5~-CCATGTCTGGCAACCAGTATACTGAGG-3~，下游引物5:CATCGTACCTTAATCCAAGTCGTCTCG-3、PCR 体系5XPCR-buffer 5μ 1,2. 5mmol/L dNTP 5 μ 1，VPl 基因上、下游引物 (20ρ θ1/μ 1)各 1μ 1，BFPV 细胞培养物 2μ IJaq DNA polymerase 0· 5 μ 1，用 DEPC 水补充至50μ 1 ；PCR反应参数96°C变性:3min，95°C预变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 150sec，进行30个循环，最后72°C再延伸10min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；将获得的BFPV-TA VPl基因片段克隆入pMDIS-T载体，转化宿主菌DH5ci ；获得重组子pBFPV/TA-VPl ；用限制性内切酶对所获得的重组子进行酶切鉴定，筛选阳性克隆、测序。
全文摘要
本发明属于微生物病毒领域。蓝狐细小病毒分离株BFPV-TA，以及该病毒VP1、VP2、NS13个基因全序列。本发明通过送检的疑是细小病毒感染的蓝狐粪便中分离分离培养和PCR鉴定，以及病毒的VP1、VP2、NS13个基因全序列测序比对，获得并证明所分离的病毒为蓝狐细小病毒毒株，命名为BFPV-TA。序列分析表明BFPV-TAVP1蛋白序列表现出了过渡型序列特征，介于FPV与CPV间的过度类型，VP2基因系统发生分析BFPV-TA与FPV的亲源关系较为密切，NS1基因系统发生分析，BFPV-TA成单独的分支，这说明狐狸有可能在CPV的起源过程起到重要的作用，本发明的毒株补充了我国蓝狐细小病毒的极有价值的遗传信息，对该病原引起感染监测体系的完善有重要作用，还可用于制备病毒感染的快速诊断试剂和疫苗研究。
文档编号C12R1/93GK102373179SQ20111021969
公开日2012年3月14日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者刘海防, 胡传伟, 谢之景, 郑江 申请人:刘海防, 胡传伟, 谢之景, 郑江