专利名称：利用毕赤酵母基因调控直接发酵制备一种抗肿瘤药物复合物的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和生物发酵领域，具体讲是利用重组毕赤酵母基因调控直接发酵制备一种抗肿瘤药物复合物的方法。
背景技术：
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α )是一种单核因子,主要由单核细胞和巨噬细胞产生。TNF-α功能多样，主要功能为杀伤、抑制肿瘤细胞。TNF-α在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖。因此近年来已采用TNF-α治疗黑素瘤等肿瘤疾病临床效果显著。 透明质酸酶(hyaluronidase, HAase)是一类在动物组织和微生物中广泛存在的酶，可将透明质酸(hyaluronic acid, HA)解聚和水解成低相对分子质量的HA或寡糖,削弱HA的黏滞性和润滑作用。HAase作为一种药物复合剂，它的功能为HA是人体内细胞间基质的主要成分，大分子的HA对药物移动到达靶位点有抑制阻碍作用；HAaSe可降解体内HA，使HA网络瓦解而降低其黏滞性，利于药物到达靶位点发挥作用。TNF- α与HAase两者配合使用作为一种抗肿瘤药物复合物，主要优点在于HAase与TNF-α合用治疗疾病时，可使抗肿瘤药物TNF-α加速到达靶位点发挥作用，并加快TNF-α吸收，提高药物疗效。
发明内容
本发明直接利用毕赤酵母表达TNF- α及HAase，并在发酵过程中通过控制发酵条件，得到不同含量配比的抗肿瘤药物复合物。该方法实现了含有不同含量配比的TNF-α及HAase的抗肿瘤药物复合物与基因调控方式的偶联，可以根据需要制备不同含量配比的抗肿瘤药物复合物，方法安全、简便、有效。本发明的目的是得到一种通过基因调控直接生成不同含量配比的抗肿瘤药物复合物的新型方法。本发明提供了一种重组毕赤酵母基因工程菌TNF-PH20，构建过程为先将组成型表达肿瘤坏死因子的重组质粒pGAPZ a A-tnf转化毕赤酵母，得到重组酵母菌TNF ;再将表达重组人透明质酸酶的诱导型重组质粒pPICZ a A-ph20转化重组酵母菌TNF，得到目标菌株 TNF-PH20。本发明提供了一种在发酵罐中，酵母基因工程菌TNF-PH20通过调节甘油及甲醇的流加时间来生产TNF-α与HAase不同含量配比的抗肿瘤药物复合物。本发明提供的毕赤酵母基因工程菌TNF-PH20及不同含量配比的抗肿瘤药物复合物的发酵生产工艺，解决了目前抗肿瘤药物中存在的疗效不佳、治愈率低等问题。
图I :肿瘤坏死因子酵母表达载体pGAPZ a A-tnf构建过程图。图2 :重组人透明质酸酶酵母表达载体pPICZ aA_ph20构建过程图。图3 :经过分离 纯化的TNF- α样品的SDS-PAGE分析图。M =Page ruler ； I :纯化后的TNF-α样品图4 :经过分离纯化的HAase样品的SDS-PAGE分析图。M Pageruler ;1_3 :纯化后的HAase样品
具体实施例方式实施例I :重组质粒pGAPZ a A-tnf及pPICZ a A-ph20的构建和毕赤酵母转化一重组质粒pGAPZ a A-tnf的构建I全基因合成肿瘤坏死因子基因tnf，tnf具有肿瘤坏死因子碱基序列表中的碱基序列(见表2)，并对其进行PCR克隆扩增，PCR引物序列如下正向5，-CCGCTCGAGGCTTCAAAGGAGGTTCCAA-3’反向5，-CATTTCTAGAAATTAACTGGCGGATTACCGGCA-3，PCR反应条件94°C 预变性 5min ;94°C 变性 Imin, 53 °C 退火 Imin, 72 °C 延伸 I. 5min, 30 个循环；72°C 延伸 10min，4°C 保温。2重组质粒的构建通过O. 7%的琼脂糖电泳检测，回收大小约为O. 8kb的PCR产物用于克隆表达。该PCR回收产物及pGAPZ a A载体通过限制性内切酶Xho I、Xba I酶切后进行连接构建重组质粒pGAPZ a A-tnf,并转化大肠杆菌T0P10感受态细胞。二重组质粒pPICZ a A_ph20的构建I ph20基因序列优化根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计ph20基因序列在人透明质酸酶基因(geneID6677)基础上，删除了信号肽及Sac I酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法将编码脯氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，丝氨酸等氨基酸的大多数密码子替换成CCA，GAA, GCA, UCA ;共修改了 18个碱基得到目的序列ph20，优化后的ph20基因序列具有重组透明质酸酶碱基序列表中的喊基序列(见表3)。2全基因合成已经优化过的重组人透明质酸酶基因ph20，并对其进行PCR克隆扩增；PCR引物序列如下正向5，-GTATCTCTCGAGAAAAGATTGAACTTCAGAGCA-3’反向5’-CAAATCTAGAGGACCTGATCAGTGAAAACAATTC-3’PCR反应条件94°C 预变性 5min ;94°C 变性 Imin, 55 °C 退火 Imin, 72 °C 延伸 2. 5min, 30 个循环；72°C 延伸 10min，4°C 保温。3重组质粒的构建通过O. 7%的琼脂糖电泳检测，回收大小约为I. 4kb的PCR产物用于克隆表达。该PCR回收产物及pPICZ a A载体通过限制性内切酶Xho I、Xba I酶切后进行连接构建重组质粒pPICZ a A-ph20,并转化大肠杆菌T0P10感受态细胞。三毕赤酵母转化
首先将线性化的重组质粒pGAPZ a A_tnf转入酵母菌中，得到重组酵母TNF，再将线性化的重组质粒pPICZ a A-ph20转入重组酵母TNF，即得到目的重组酵母TNF-PH20。具体酵母转化步骤如下(I)挑取酵母单菌落，接种至含有5mL YI3D培养基的50mL三角瓶中，30°C培养过夜；(2)取O. 2mL的培养物接种至含有500mL新鲜培养基的2L三角摇瓶中，过夜生长至 OD6tltl 达到 I. 3 I. 5 ;(3)在4°C，1500g离心5min收集细胞，用500mL预冷的灭菌水悬浮细胞；同样条件离心，用250mL预冷的灭菌水悬浮细胞；
(4)按步骤3离心，用20mL预冷的lmol/L山梨醇悬浮细胞；如上离心，用ImL预冷的lmol/L山梨醇悬浮细胞；80 μ L分装；(5)将5 20 μ g的线性化DNA溶解在5 10 μ L TE溶液中，与80 μ L的酵母感受态细胞混匀，转至O. 2cm冰预冷的电转化杯中；(6)冰上放置5min，根据所使用装置推荐的酵母参数进行电击；立即加入ImL预冷的lmol/L山梨醇至杯中，将内容物转至灭菌离心管中；(7)将菌体悬液涂布于含有适量抗生素的YPDS平板上，每600 μ L涂布平板；将平板置于30°C培养，直至单个菌落出现。实施例2 :酵母工程菌TNF-PH20发酵生产不同含量配比的抗肿瘤药物复合物的方法在I升发酵罐中，酵母工程菌TNF-PH20可直接生产不同含量配比的抗肿瘤药物复合物。在30°C条件下，利用YPD培养基将重组酵母菌TNF-PH20活化培养18 24小时；按
O.5% 2%的比例将活化后的酵母菌转接入YPD种子培养基中，上罐发酵方法如下(I)菌体培养阶段发酵温度设定为28 30°C，利用28%的氨水将发酵培养基的PH值调至5. O 6. 0，然后按5% 10%的接种量将种子培养基接种入Basal Salts上罐培养基中(配方为85%磷酸26. 7mL/L，硫酸钙O. 93g/L，硫酸钾18. 2g/L，硫酸镁14. 9g/L，氢氧化钾4. 13g/L，甘油40g/L)，同时添加4. 37mL PTMl盐溶液(配方为硫酸铜6g/L，碘化钠O. 08g/L,硫酸镁3. Og/L,钥酸钠O. 2g/L，硼酸O. 02g/L,氯化钴O. 5g/L，氯化锌20. Og/L，硫酸亚铁20. Og/L,生物素0. 2g/L，硫酸5mL/L)。通气搅拌18 24小时；(2)甘油补料阶段(肿瘤坏死因子组成型表达阶段)流加30% 50%的甘油，流加量为10 20mL/hr/L，培养24 48小时左右，整个过程中溶氧量大于20%。该过程既是酵母生长阶段即菌体湿重大量增加阶段，也是肿瘤坏死因子组成型表达阶段，在此过程中TNF- α被快速积累；(3)甲醇诱导阶段(重组人透明质酸酶诱导型表达阶段)流加甘油至一定时间后停止流加，更换甲醇为碳源，流加速度为4 8mL/hr/L，继续培养24 48小时，整个过程中溶氧量大于20%。该过程流加甲醇可诱导AOXl启动子作用并开始表达重组人透明质酸酶，在此过程中可通过分别调控甘油及甲醇的流加时间来获得TNF- α与HAase不同含量配比的抗肿瘤药物复合物。(4)将获得的发酵液离心，取上清，选择不同规格的超滤膜进行超滤，分别获得分子量为32kDa的TNF- α及分子量为55kDa的HAase。最后进行凝胶层析，纯度可达90%。在发酵过程中通过对甘油及甲醇流加时间的控制及后期纯化，最终得到的抗肿瘤药物复合物的含量配比见表I。表I抗肿瘤药物复合物的含量配比
权利要求
1.一种通过基因调控直接生产抗肿瘤药物复合物的毕赤酵母基因工程菌HAS-PH20。
2.权利要求I所述的毕赤酵母，其特征在于该酵母细胞为毕赤酵母KM71或SMD1168。
3.权利要求I所述的酵母基因工程菌TNF-PH20，其特征在于先将重组质粒pGAPZ a A-tnf转化毕赤酵母，得到重组酵母菌TNF ;再将重组质粒pPICZ a A_ph20转化酵母菌TNF，得到目标菌株TNF-PH20。
4.权利要求3所述的重组质粒pGAPZa A-tnf,其特征在于在GAP组成型启动子的调控下，该重组质粒可表达TNF- α，所述的肿瘤坏死因子基因tnf具有肿瘤坏死因子碱基序列表中的碱基序列。
5.权利要求3所述的重组质粒pPICZa A_ph20，其特征在于在AOXl诱导型启动子的调控下，该重组质粒可表达HAase ;重组人透明质酸酶基因ph20是按照毕赤酵母偏好性设计的DNA分子，该分子的核苷酸序列所编码的氨基酸，与人透明质酸酶基因(gene ID6677)所编码的氨基酸完全相同。
6.权利要求5所述的ph20基因序列，其特征在于ph20基因序列是在人透明质酸酶基因(gene ID6677)基础上，删除了信号肽及Sac I酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法将编码脯氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，丝氨酸等氨基酸的密码子替换成CCA，GAA, GCA, UCA ;共修改了 18个碱基得到目的序列ph20，所述的ph20基因序列具有重组人透明质酸酶碱基序列表中的碱基序列。
7.权利要求I中毕赤酵母基因工程菌TNF-PH20发酵生产抗肿瘤药物复合物的方法，其特征在于 在30°C条件下，利用YPD培养基将重组酵母菌TNF-PH20活化培养18 24小时；按O.5% 2%的比例将活化后的酵母菌转接入YPD种子培养基中，上罐发酵方法如下 (1)菌体培养阶段发酵温度设定为28 30°C，利用28%的氨水将发酵培养基的PH值调至5. O 6. 0，然后按5 % 10 %的接种量将种子培养基接种入Basal Salts上罐培养基中，同时添加4. 37mL PTMl盐溶液。通气搅拌18 24小时； (2)甘油补料阶段(肿瘤坏死因子组成型表达阶段)流加30% 50%的甘油，流加量为10 20mL/hr/L，培养24 48小时左右，整个过程中溶氧量大于20%。该过程既是酵母生长阶段即菌体湿重增加阶段，也是肿瘤坏死因子组成型表达阶段，在此过程中TNF- α被快速积累； (3)甲醇诱导阶段(重组人透明质酸酶诱导型表达阶段)流加甘油至一定时间后停止流加，更换甲醇为碳源，流加速度为4 8mL/hr/L，继续培养24 48小时，整个过程中溶氧量大于20%。该过程流加甲醇可诱导AOXl启动子作用并开始表达重组人透明质酸酶，在此过程中可通过分别调控甘油及甲醇的流加时间来获得TNF-α与HAase不同含量配比的抗肿瘤药物复合物。
全文摘要
本发明涉及一种利用毕赤酵母基因调控发酵生产抗肿瘤药物复合物的新方法。该方法包括将重组质粒pGAPZαA-tnf[可组成型表达肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)]和pPICZαA-ph20[可诱导型表达重组人透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)]分别转化酵母细胞，得到基因工程菌TNF-PH20。在后期发酵过程中通过不同的基因调控和诱导方式，利用酵母工程菌TNF-PH20生产目标产物——TNF-α和HAase的药物复合物。TNF-α是一种常用抗肿瘤药物，HAase与TNF-α合用可使TNF-α加速到达靶位点发挥作用，并加快了药物TNF-α的吸收，从而提高了药物疗效。该方法实现了抗肿瘤药物复合物TNF-α与HAase的含量配比与基因调控方式的偶联，可以根据需要制备不同含量配比的抗肿瘤药物复合物。
文档编号C12N15/63GK102911886SQ20111021928
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者朱希强, 刘飞, 张莉, 刘霞, 钊倩倩, 王绍花, 陈勉, 侯重文, 袁丹丹, 张林军, 陈晓燕 申请人:山东省生物药物研究院