专利名称：一种复合微生物菌剂及其固定化方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合微生物菌剂及其固定化方法与应用，特别涉及一种人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3的复合微生物菌剂及其固定化方法与应用。
背景技术：
以为代表的含硫恶臭物质因其来源极广，含量大，毒性极强，难于治理，国内外一致把含硫工业废气的处理作为工业三废处理和大气污染物控制的一项重要任务。生物脱硫技术是大气污染控制的有效手段，然而微生物通常在水中以悬浮态生长，由于其与水的密度差小，易于从反应器中流失，因此如何从流出的水中回收微生物进行重复使用成了生物脱硫面临的主要难题。固定化技术是利用物理或化学手段将酶、微生物细胞等生物催化剂限制于某一特定空间范围内，并保持其生物活性，使之能够重复和连续使用。与传统的悬浮生物处理法相比，该技术具有提高反应速率和处理效能、保持高活性高浓度菌种、提高处理负荷、减小装置体积、产污泥量少、固液分离效果好、能够多次重复使用、增强对有毒物质的承受能力和降解能力等优点。目前该技术已经普遍应用于工业、医药、化学分析、环境污染治理与检测和能源开发等多种领域。固定化微生物的制备方法大致可以分为共价结合法、交联法、吸附法和包埋法四种，由于包埋剂的保护作用避免了微生物直接暴露于各种有毒废水中而使得通过该方法固定的细胞具有很好的稳定性，包埋法成为目前研究和应用最广泛的方法。随着固定化微生物技术在废水治理领域中的深入研究，科学工作者们开始把该项技术引入废气治理领域中，并取得了一些成果。美国PimjaiT. klvaraj等分别使用卡拉胶包埋法和聚合多孔BIO-SEP颗粒吸附法进行了处理含SO2气体的研究。李晶等利用FPU (功能化大孔聚胺酯交联载体)固定化微生物，在生物滴滤塔反应系统中进行脱除吐3的研究， 同时对比测定未固定化微生物的FPU滴滤系统对H2S的吸附能力。同济大学的邵立明等采用海藻酸钙包埋污泥制成固定化微生物，将其填充在生物滴滤塔中进行了固定化微生物处理含气体的试验研究。本发明中的人苍白杆菌Ochrobactrum sp. B3与根瘤杆菌Iihizobium sp. T3是活性污泥中筛选得到的具有降解H2S能力的优势菌。经检索专利和其他相关文献，尚未发现人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3制备复合微生物菌剂及利用海藻酸钠-PVA复合载体固定化上述复合微生物菌剂降解的报道，该固定化方法的发现对废气中等含硫恶臭污染物的高效净化具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供一种人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3的复合微生物菌剂及其固定化方法与在微生物降解硫化氢中的应用，该复合微生物菌剂具有较高的降解硫化氢的效率及较高的耐受浓度，对温度和PH性能稳定，复合微生物菌剂固定化细胞颗粒可重复使用， 能够适应复杂的实际条件。
本发明采用的技术方案是一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂由人苍白杆菌B3 (OchrcAactrum sp. B3)含菌细胞菌悬液和根瘤杆菌T3 (lihizobium sp. T3)含菌细胞菌悬液组成，所述的复合微生物菌剂中人苍白杆菌B3菌体浓度为0. 15 0. 2g/L，所述的根瘤杆菌T3的菌体浓度为 0. 15 0. 2g/L。本发明所述的复合微生物菌剂由以下体积配比的原料混合制成菌体浓度为 0. 4 0. 5g/L的人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度为0. 4 0. 5g/L的根瘤杆菌 T3含菌细胞菌悬液等体积混合。本发明所述的复合微生物菌剂为复合微生物菌剂的固定化细胞，所述的复合微生物菌剂按如下方法制得用固定化方法以海藻酸钠-PVA的水溶液为复合载体，以人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液为复合微生物菌剂，于交联剂中进行细胞固定化，获得人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂的固定化细胞，所述的复合载体中海藻酸钠与PVA和水的投料质量比为1 3.5 45. 5，所述的复合载体与复合微生物菌剂质量比为 200 300 1 ；所述的复合微生物菌剂为菌体浓度0.4 0.5g/L人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度0. 4 0. 5g/L根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液等体积混合的菌剂；所述的交联剂为氯化钙、硼酸混合水溶液，所述的交联剂中氯化钙、硼酸的质量终浓度分别为IOg/ L、40g/L。所述的复合微生物菌剂的固定化细胞颗粒采用注射器或滴管吸取海藻酸钠-PVA 的水溶液和菌体的混合液滴于交联剂中进行细胞固定化，得到的固定化细胞颗粒直径为 2. 0 2. 5mmο本发明所述复合微生物菌剂按照如下步骤制备(1)斜面培养分别将人苍白杆菌B3 (Ochrobactrum sp. B3)与根瘤杆菌 T3 (Rhizobium Sp.T3)接种于斜面培养基，30°C厌氧培养Mh，获得人苍白杆菌B3斜面菌体与根瘤杆菌T3斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L， 氯化钠10g/L,琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7. 0 7. 2，121°C灭菌15min ；(2)种子培养分别将步骤(1)制备的人苍白杆菌B3斜面菌体与根瘤杆菌T3斜面菌体接种于种子培养基，以气体为硫源，30°C厌氧培养48h，获得人苍白杆菌B3种子液与根瘤杆菌T3种子液；所述的H2S初始浓度为150 250ppm ；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖 0. 2g/L，KH2PO4 1. 2g/L，K2HPO4 1. 2g/L，NH4Cl 0. 4g/L，MgCl2 · 6H20 0. 2g/ L,柠檬酸铁0. Olg/L,溶剂为水，初始pH值7. 0 ；(3)含菌细胞菌悬液的制备分别将步骤(2)制备的人苍白杆菌B3种子液与根瘤杆菌T3种子液离心浓缩，弃去上清液，沉淀分别用无菌水稀释，分别获得菌体浓度为0. 4 0. 5g/L人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度为0. 4 0. 5g/L根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液；(4)复合微生物菌剂将步骤C3)制备的人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液等体积混合，获得复合微生物菌剂；所述的复合微生物菌剂中菌体总浓度为0. 3 0. 4g/L ；(5)复合微生物菌剂细胞固定化a)将海藻酸钠、PVA与水混合加热至完全溶化，静置冷却至50°C，获得复合载体；所述的复合载体中海藻酸钠与PVA和水的质量比为1 3.5 45. 5 ;b)将CaCl2、硼酸混合，溶解于水中，制备交联剂溶液；所述的交联剂溶液中CaCl2的质量终浓度为10g/L，硼酸的质量终浓度为40g/L ；c)将步骤(4)制备的复合微生物菌剂与步骤a)制备的复合载体混合，获得混合液；所述的复合载体与复合微生物菌剂的质量比为200 300 1，所述的复合微生物菌剂的菌体总浓度为0.3 0.4g/L;d)将步骤c)所制备的混合液用注射器或滴管滴入步骤b)制备的交联剂溶液中，形成固定化细胞颗粒悬浮液，常温下固化Mh，用生理盐水冲洗，获得复合微生物菌剂固定化细胞颗粒，4°C 保存备用。本发明所述的复合微生物菌剂在微生物降解中的应用。所述的应用为以人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂或复合微生物菌剂的固定化细胞颗粒为酶源，以H2S为唯一硫源，在无机培养基中20 40°C，pH 5. 0 9. 0， 厌氧培养2 3d，使H2S降解；所述的H2S初始浓度为100 500ppm ；所述的复合微生物菌剂或复合微生物菌剂的固定化细胞颗粒中菌体总浓度为0. 3 0. 4g/L ；所述的无机培养基的终浓度组成为 NH4Cl 0. 04g/L，MgCl2 · 6H20 0. 02g/L，K2HPO4 0. lg/L，KH2PO4O. lg/L，CaCl2 0. 02g/L，葡萄糖 0. 2g/L，酵母粉 0. 2g/L，pH 7. 0 7. 2。本发明所述的复合微生物菌剂在微生物降解吐3中的应用具体按照以下步骤进行(1)将人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂或复合微生物菌剂固定化细胞颗粒于无机培养基中30°C培养Mh，备用；所述的无机培养基终浓度组成为=NH4Cl 0. 04g/L, MgCl2 · 6H20 0. 02g/L, K2HPO4 0. lg/L, KH2PO4 0. lg/L, CaCl2 0. 02g/L,葡萄糖 0. 2g/L，酵母粉0. 2g/L，pH7.0 7.2，溶剂为水，吐5气体为硫源；0)分别将步骤(1)活化后的人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3微生物复合菌剂、微生物复合菌剂固定化细胞颗粒接种于无机培养基中，pH 5. 0 9. 0、温度为30°C、H2S初始浓度100 500ppm的条件下，160rpm 摇床厌氧培养60h，跟踪检测硫化氢降解性能；所述的人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂、复合微生物菌剂固定化细胞颗粒菌体总浓度分别为0. 3 0. 4g/L、0. 3 0. 4g/ L ；所述的无机培养基组成与步骤(1)无机培养基组成相同。本发明采用气相色谱法跟踪检测初始H2S和反应过程中的H2S浓度来测知H2S降解性能；所述的气相色谱法为采用岛津GC-14B气相色谱仪分析测定硫化氢浓度，色谱柱为HP-Irm0wax毛细管柱(30m X0. 32mm X 0. 5 μ m)，汽化室、火焰光度检测器、柱温分别设置为25°C、88°C、48°C，柱流量lmL/min，进样量10 μ L，N2为载气，总流量为200mL/min，分流比为10 1，氢气流量和空气流量分别为50mL/min和50mL/min。本发明所述的含菌细胞菌悬液中菌体浓度以菌体干重计，所述的菌体干重测量方法为分别将人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液、根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液和人苍白杆菌 B3含菌细胞菌悬液与根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液混合液用722型紫外分光光度计测定 0D_值，分别将菌悬液置于烘箱中105°C烘至恒重，以0D_值为横坐标，以菌体干重为纵坐标，绘制标准曲线，试验中所需菌体干重根据标准曲线来计算，进而计算实验所需菌体浓度。本发明所述的复合微生物菌剂及复合微生物菌剂固定化细胞颗粒均可用于微生物降解H2S的应用中，复合微生物菌剂固定化细胞颗粒相对游离复合微生物菌剂，具有一定的抗毒性，对温度、PH值的耐受性强，重复使用多次仍能保持对H2S废气的高效降解。
本发明人苍白杆菌B3 (Ochrobactrum sp. B3)、根瘤杆菌 T3 (Rhizobium sp. T3)， 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年4月2日，保藏编号分别为CCTCC M 2011104、CCTCC M 2011105，保藏地址湖北省武汉市武昌珞珈山。本发明人苍白杆菌B3 (Ochrobactrum sp. B3)、根瘤杆菌 T3 (Rhizobium sp. T3) 菌株的获得从浙江华海制药厂废水处理站中取水样，通过样品驯化，初筛，复筛，获得具有硫化氢降解能力的纯培养物，对该纯培养物进行形态和生理生化鉴定，并对其16S rDNA 基因同源性作了分析，将其分别鉴定为人苍白杆菌B3(0chrobactrUm sp.B3)、根瘤杆菌 T3 (Rhizobium sp.T3)。人苍白杆菌B3 (Ochrobactrum sp. B3)菌株形态球状，大小为0. 8 1. 0 μ mX 1. 0 1. 2 μ m，侧生鞭毛，革兰氏染色为阴性，在无机盐固体培养基中30°C培养 1 2d后，菌落呈圆形，表面乳白色半透明，边缘整齐干燥，不易挑起；透射电镜照片如图1 中A-I所示；菌株的生理生化特征接触酶阳性，葡萄糖发酵产酸，硝酸盐还原产气，硫化氢试验呈阳性，有黑色沉淀物产生。根瘤杆菌T3 (Rhizobium sp. T3)菌株形态杆状，大小为0. 5 0. 7 μ mX 1. 2 1. 5μπι，侧生鞭毛，革兰氏染色为阴性，在无机盐固体培养基中30°C培养1 2d后，菌落呈圆形，表面白色透明，边缘光滑湿润，易挑起；透射电镜照片如图1中A-2所示；菌株的生理生化特征接触酶阳性，葡萄糖发酵产酸，硝酸盐还原产气，硫化氢试验呈阳性，有黑色沉淀物产生。采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2. 2上海申能博彩生物科技有限公司)分别对人苍白杆菌B3、根瘤杆菌T3进行提取和纯化，选用细菌通用引物BSF8/20和 BSR1541/20进行PCR扩增，引物序列分别为BSF8/20 5' -AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'BSR1541/20 5' -AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'PCR反应程序设定为先94°C预变性^iin ；然后94°C变性lmin，59°C退火lmin， 72°C延伸1. 5min，循环35个周期；然后72°C延伸IOmin ；最后4°C保持lOmin。将PCR产物进行测序，测序得到SEQ ID No. 1的序列，利用BLAST将所测得序列与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右的长度进行比对[Clustelx (1. 81)]， 采用邻位连接(Neighbour Joining, NJ)法进行系统学分析(MEGA)，确定了人苍白杆菌B3 菌株的系统发育树，如图1中B-I所示、根瘤杆菌T3菌株的系统发育树如图1中B-2所示。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明利用海藻酸钠-PVA复合载体固定化人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂，获得固定化细胞颗粒并用于废气中H2S气体的降解，不仅有很高的降解效率和耐受浓度，对温度和pH值等的稳定性，而且可实现重复脱硫，多批试验后仍能保持较高的生物活性和机械强度，本发明复合微生物菌剂固定化细胞颗粒可用于替代悬浮微生物对废气中气体进行高效降解，能适应复杂的实际条件，具有明显的经济效益和更广阔的应用前景。
图1为根瘤杆菌T3、人苍白杆菌B3的透射电镜照片及系统发育树图，A-I为人苍白杆菌B3的透射电镜照片，A-2为人苍白杆菌B3菌株的系统发育树；B-I为根瘤杆菌T3的透射电镜照片，B-2为根瘤杆菌T3菌株的系统发育树；图2为人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂固定化细胞颗粒实物图；图3为人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂固定化细胞颗粒对不同初始浓度的降解性能比较图，3-1为复合微生物菌剂游离细胞降解性能图，3-2为复合微生物菌剂固定化细胞颗粒降解吐3性能图；图4为人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3混合微生物菌剂固定化细胞颗粒在不同温度下对H2S的降解性能比较图；图5为人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3混合微生物菌剂固定化细胞颗粒在不同pH 值下对H2S的降解性能比较图；图6为人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3混合微生物菌剂固定化细胞颗粒与人苍白杆菌B3游离细胞、根瘤杆菌T3游离细胞重复脱硫性能图，横坐标为重复脱硫次数，纵坐标为 H2S去除率。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂及固定化细胞颗粒的制备本发明所述的无机培养液终浓度组成为=NH4Cl 0. 04g/L, MgCl2 · 6H20 0. 02g/L, K2HPO4 0. lg/L，KH2PO4 0. lg/L，CaCl2 0. 02g/L，葡萄糖 0. 2g/L，酵母粉 0. 2g/L，pH 7. 0 7. 2，溶剂为水，H2S气体为硫源。(1)斜面培养分别将人苍白杆菌B3 (Ochrobactrum sp. B3)与根瘤杆菌 T3 (Rhizobium sp. T3)接种于斜面培养基，30°C厌氧培养Mh，获得人苍白杆菌B3斜面菌体与根瘤杆菌T3斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L， 氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，调节pH至7. 0 7. 2，121°C灭菌15min ；(2)种子培养分别将步骤(1)制备的人苍白杆菌B3斜面菌体与根瘤杆菌T3斜面菌体接种于种子培养基，以气体为硫源，30°C厌氧培养48h，获得人苍白杆菌B3种子液与根瘤杆菌T3种子液；所述的吐3初始浓度为200ppm;所述的种子培养基终浓度组成为 葡萄糖 0. 2g/L，KH2PO4L 2g/L，K2HPO4 1. 2g/L，NH4Cl 0. 4g/L，MgCl2 · 6H20 0. 2g/L，柠檬酸铁0. Olg/L,溶剂为水，pH值7. 0 ；(3)含菌细胞菌悬液的制备分别将步骤(2)制备的人苍白杆菌B3种子液与根瘤杆菌T3种子液离心浓缩，弃去上清液，沉淀分别用无菌水稀释，获得菌体浓度为0. 43g/L人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度为0. 43g/L根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液；(4)复合微生物菌剂将步骤( 制备的人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液等体积混合，获得复合微生物菌剂IOOmL;所述的复合微生物菌剂中菌体总浓度为0. 35g/L ；(5)复合微生物菌剂细胞固定化a)将2g海藻酸钠、7g PVA与91g水加热至完全溶化，静置冷却至50°C，获得复合载体IOOg ；b)将lgCaCl2、4g硼酸混合，先溶解于少量蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至IOOmL,制备得到交联剂溶液；c)将步骤(4)制备的复合微生物菌剂0. 035g与步骤a)制备的复合载体IOOg混合，获得混合液；所述的复合微生物菌剂的
8菌体总浓度为0. 35g/L ；d)将步骤c)所制备的混合液用滴管滴入步骤b)制备的交联剂溶液中，形成固定化细胞颗粒悬浮液，常温(25°C)下固化Mh，用生理盐水冲洗，获得复合微生物菌剂固定化细胞颗粒，固定化细胞颗粒粒径为2mm，4°C保存备用。实施例2人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂固定化细胞颗粒性能测定(1)颗粒强度挑选50粒实施例1方法制备的粒径均勻的人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3混合微生物菌剂固定化细胞颗粒，加水lOOmL，300r/min摇床振荡培养24h后，观察颗粒破损情况，以此来描述颗粒的强度，实验结果未出现破损的情况，表明固定化小球具有良好的机械强度。(2)颗粒传质性能在250mL小烧杯中加入IOOmL经稀释的蓝墨水(宁海星光文教用品有限公司) (5mL蓝墨水加入IOOmL水)，称取4. Og实施例1方法制备的人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3 混合微生物菌剂固定化细胞颗粒，分别置于上述加入稀释蓝墨水烧杯中30°C放置Mh，取出固定化颗粒用水冲洗后，切开颗粒观测其内部染色程度，以此来评价颗粒的传质性能，实验发现固定化小球中90%以上颗粒内部被染成蓝色。实施例3人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂对不同初始浓度的降解性能检测1)将人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂和复合微生物菌剂固定化细胞颗粒分别于无机培养基中30°C活化Mh，备用。2)分别将步骤(1)活化后的菌体总浓度0. 35g/L人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3 复合微生物菌剂游离细胞5mL和复合微生物菌剂固定化细胞颗粒4. Og接种于20mL无机培养基中，于250mL厌氧瓶中，pH = 7. 0，30°C，160rpm的摇床中振荡培养24h后，气相色谱法检测H2S的残留量，结果见图3，H2S初始浓度分别设置为100ppm、200ppm、300ppm、400ppm、 500ppmo气相色谱法检测H2S残留量的方法采用岛津GC-14B气相色谱仪分析测定硫化氢浓度，色谱柱为HP-Innowax毛细管柱(30mX0. 32mmX0. 5ym)；汽化室、FPD (火焰光度检测器检测器)、柱温分别设置为25°C、88°C、48°C，柱流量lmL/min，进样量10 μ L，N2为载气，总流量为200mL/min，分流比为10 1 ；氢气流量和空气流量分别为50mL/min和50mL/min， 此方法简便、快速、灵敏度高、重复性控制在5%以内，可以实现对10_6微量级的硫化氢的定量测定，硫化氢出峰时间为0. 523min左右。图3表明，当H2S初始浓度从IOOppm上升到300ppm时，复合微生物菌剂固定化细胞颗粒和游离复合微生物菌剂细胞降解率基本上相当；随着吐3初始浓度继续上升，从 400ppm上升到600ppm时，对于固定化细胞颗粒，随着浓度进一步增加，降解速率保持稳定， 而游离细胞降解率降低较快，可见固定化细胞颗粒能够忍受高浓度H2S的毒性。原因为细胞在固定化颗粒内，形成了许多微菌落，微菌落相互间起保护作用，当H2S通过扩散作用进入固定化细胞颗粒内部，扩散使H2S浓度从小球外部到内部逐渐降低，形成梯度屏障，减轻了 H2S对载体内细胞的毒性，这些都有利于细胞对的降解并提高其耐受性。另一方面， 固定化载体能引起细胞内外渗透压的改变，这种变化会促进细胞内化合物过量分泌，减少细胞内水的流动，从而提高细胞对高浓度毒性的耐受性。实施例4人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂在不同温度下降解H2S的特性H2S初始浓度为200ppm，培养温度分别为20°C、25°C、30°C、35°C、40°C，分别以人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂游离细胞和人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂固定化细胞颗粒为酶源，其它操作同实施例3，结果见图4 ；图4可以看出，在30°C时细胞生长繁殖速度加快，复合微生物菌剂游离细胞与复合微生物菌剂固定化细胞降解吐3的速率都达到最大值；随着温度继续上升，降解速率下降。固定化细胞对于环境温度的波动不敏感，温度升至40°C时，降解率仍保持80%，而游离细胞的降解率只有63%，可见细胞经固定化后，载体能对细胞起到较好的保护作用，从而增强细胞的热稳定性。实施例5人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂在不同pH值下降解H2S的特性采用lmol/L的NaOH溶液和lmol/L HCl溶液调节培养基初始pH值分别为5. 0、 6.0,7.0,8.0,9.0, H2S初始浓度为200ppm,分别以人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂游离细胞和人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂固定化细胞颗粒为酶源， 其它操作同实施例3，结果见图5。对于游离细胞，当pH < 7. 0时，H2S的平均降解速率随pH的增加而增加；pH >7.0 的降解速率随PH值的增加而下降，说明细胞中降解酶的活性在pH = 7. 0时最大。对于固定化细胞，由于固定化细胞内具有良好的传质性能，不影响底物、溶解氧和其他物质的扩散，降解速率表现出较游离细胞稍高。同时由于固定化基质为细胞提供了一个稳定的独立微环境，使酶的活性位点有了更宽的适应范围，因而降解速率曲线变化平缓，固定化细胞对于外界PH值的波动不敏感。实施例6人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂的重复脱硫能力考察了固定化细胞重复降解H2S的情况，H2S初始浓度为200ppm，分别以人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂游离细胞和人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂固定化细胞颗粒为酶源，其他操作同实施例3，每隔4 取样测定的降解情况，然后复合微生物菌剂固定化细胞颗粒用生理盐水洗涤，同样条件下重复上述操作，游离细胞在前面的批次基础上，重新加入压一初始浓度为200ppm，进行重复脱硫实验，实验结果6。由图6可以看出，固定化细胞的脱硫能力下降的不是很快，经过5次使用后仍然有50%左右的降解率，而游离细胞的脱硫能力下降很快，在第3次重复试验中降解率已经低于50%，采用固定化技术将其固定在载体上反复使用，可以达到简化工艺、降低成本的目的，说明固定化细胞的重复脱硫能力比游离细胞有了很大的提高，具有潜在的应用前景。生物催化剂的重复使用性对降低成本、提高效益有重要意义，因此每一种生物脱硫工艺都很重视生物催化剂的使用寿命和使用次数，与游离细胞相比，固定化菌种具有固液分离效果好、产污泥量少，能够多次重复使用等优点。
权利要求
1.一种复合微生物菌剂，其特征在于所述的复合微生物菌剂由人苍白杆菌 B3 (Ochrobactrum sp. B3)含菌细胞菌悬液和根瘤杆菌T3 (Rhizobium sp. T3)含菌细胞菌悬液组成，所述的复合微生物菌剂中人苍白杆菌B3菌体浓度为0. 15 0. 2g/L，所述的根瘤杆菌T3的菌体浓度为0. 15 0. 2g/L。
2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于所述的复合微生物菌剂由以下体积配比的原料混合制成菌体浓度为0. 4 0. 5g/L的人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度为0. 4 0. 5g/L的根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液等体积混合。
3.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于所述的复合微生物菌剂为复合微生物菌剂的固定化细胞，所述的复合微生物菌剂按如下方法制得用固定化方法以海藻酸钠-PVA的水溶液为复合载体，以人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液为复合微生物菌剂，于交联剂中进行细胞固定化，获得人苍白杆菌B3与根瘤杆菌 T3复合微生物菌剂的固定化细胞；所述的复合载体中海藻酸钠与PVA和水的投料质量比为 1 3.5 45. 5，所述的复合载体与复合微生物菌剂质量比为200 300 1 ；所述的复合微生物菌剂为菌体浓度0. 4 0. 5g/L人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度0. 4 0. 5g/L根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液等体积混合的菌剂；所述的交联剂为氯化钙、硼酸混合水溶液，所述交联剂中氯化钙、硼酸的质量终浓度分别为10g/L、40g/L。
4.如权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于所述的复合微生物菌剂的固定化细胞颗粒采用注射器或滴管吸取海藻酸钠-PVA的水溶液和菌体的混合液滴于交联剂中进行细胞固定化，得到的固定化细胞颗粒直径为2. 0 2. 5mm。
5.如权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于所述的复合微生物菌剂按照如下步骤制备(1)斜面培养分别将人苍白杆菌B3(Ochrobactrum sp. B3)与根瘤杆菌T3 (Rhizobium sp. T3)接种于斜面培养基，30°C厌氧培养24h，获得人苍白杆菌B3斜面菌体与根瘤杆菌T3 斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L， 琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7. 0 7. 2，121°C灭菌15min ；(2)种子培养分别将步骤(1)制备的人苍白杆菌B3斜面菌体与根瘤杆菌T3斜面菌体接种于种子培养基，以H2S气体为硫源，30°C厌氧培养48h，分别获得人苍白杆菌B3种子液与根瘤杆菌T3种子液；所述的H2S初始浓度为150 250ppm ；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖 0. 2g/L，KH2PO4L 2g/L，K2HPO4 1. 2g/L，NH4Cl 0. 4g/L，MgCl2 · 6H20 0. 2g/L， 柠檬酸铁0. Olg/L,溶剂为水，初始pH值7. 0 ；(3)含菌细胞菌悬液的制备分别将步骤(2)制备的人苍白杆菌B3种子液与根瘤杆菌T3种子液离心浓缩，弃去上清液，沉淀分别用无菌水稀释，分别获得菌体浓度为0. 4 0. 5g/L人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与菌体浓度为0. 4 0. 5g/L根瘤杆菌T3含菌细胞菌悬液；(4)复合微生物菌剂将步骤(3)制备的人苍白杆菌B3含菌细胞菌悬液与根瘤杆菌T3 含菌细胞菌悬液等体积混合，获得复合微生物菌剂；所述的复合微生物菌剂中菌体总浓度为 0. 3 0. 4g/L ；(5)复合微生物菌剂细胞固定化a)将海藻酸钠、PVA与水混合加热至完全溶化， 静置冷却至50°C，获得复合载体；所述的复合载体中海藻酸钠与PVA和水的质量比为`1 3.5 45. 5 ;b)将CaCl2、硼酸混合，溶解于水中，制备交联剂溶液；所述的交联剂溶液中CaCl2的质量终浓度为10g/L，硼酸的质量终浓度为40g/L ；c)将步骤(4)制备的复合微生物菌剂与步骤a)制备的复合载体混合，获得混合液；所述的复合载体与复合微生物菌剂的质量比为200 300 1，所述的复合微生物菌剂的菌体总浓度为0.3 0.4g/L;d)将步骤c)所制备的混合液用注射器或滴管滴入步骤b)制备的交联剂溶液中，形成固定化细胞颗粒悬浮液，常温下固化Mh，用生理盐水冲洗，获得复合微生物菌剂固定化细胞颗粒，4°C 保存备用。
6.一种如权利要求1复合微生物菌剂在微生物降解吐3中的应用。
7.如权利要求6所述的复合微生物菌剂在微生物降解中应用，其特征在于所述的应用为以人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂或复合微生物菌剂的固定化细胞颗粒为酶源，以H2S为唯一硫源，在无机培养基中20 40°C，pH 5. 0 9. 0，厌氧培养2 3d，使H2S降解；所述的H2S初始浓度为100 500ppm ；所述的复合微生物菌剂或复合微生物菌剂的固定化细胞颗粒中菌体总浓度为0. 3 0. 4g/L ；所述的无机培养基的终浓度组成为=NH4ClO. 04g/L, MgCl2 · 6H20 0. 02g/L, K2HPO4 0. lg/L, KH2PO4 0. lg/L, CaCl2 0. 02g/L,葡萄糖0. 2g/L，酵母粉0. 2g/L，溶剂为水，pH 7. 0 7. 2。
8.如权利要求6所述的复合微生物菌剂在微生物降解中应用，其特征在于所述的应用按照以下步骤进行(1)将人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂或复合微生物菌剂固定化细胞颗粒于无机培养基中30°C培养Mh，备用；所述的无机培养基终浓度组成为=NH4Cl 0. 04g/L， MgCl2 · 6H20 0. 02g/L, K2HPO4 0. lg/L, KH2PO4 0. lg/L, CaCl2 0. 02g/L，葡萄糖 0. 2g/L，酵母粉0. 2g/L，pH 7.0 7. 2，溶剂为水，H2S气体为硫源；(2)分别将步骤(1)活化后的人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3微生物复合菌剂、复合微生物菌剂固定化细胞颗粒接种于无机培养基中，pH 5. 0 9. 0、温度为30°C、H2S初始浓度100 500ppm的条件下，160rpm摇床厌氧培养60h，跟踪检测硫化氢降解性能；所述的人苍白杆菌B3与根瘤杆菌T3复合微生物菌剂固定化细胞颗粒和复合微生物菌剂的菌体总浓度分别为0. 3 0. 4g/L、0. 3 0. 4g/L ；所述的无机培养基组成与步骤(1)无机培养基组成相同。
全文摘要
本发明公开了一种复合微生物菌剂及其固定化方法和应用，所述的复合微生物菌剂由人苍白杆菌B3(Ochrobactrum sp.B3)含菌细胞菌悬液和根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)含菌细胞菌悬液组成，所述的复合微生物菌剂中人苍白杆菌B3菌体浓度为0.15～0.2g/L，所述的根瘤杆菌T3的菌体浓度为0.15～0.2g/L；本发明所述复合微生物菌剂固定化方法工艺简单，原材料价廉易得，有利于大规模生产，本发明复合微生物菌剂固定化细胞颗粒机械强度高，弹性好，酶活稳定，在反应体系中有一定的抗毒性，对温度、pH值的耐受性强，重复使用多次仍能保持对H2S废气的高效降解。
文档编号C12N11/08GK102321549SQ201110218629
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者吴晓薇, 姜理英, 王惠祥, 陈建孟 申请人:浙江工业大学