专利名称：甘蔗黑穗病菌巢式pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及甘蔗病原菌检测领域，具体是检测甘蔗黑穗病菌的方法。
背景技术：
由甘蔗黑粉菌(feii^^o SCiteffliz^a)引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害，也是我国一种经济危害性最严重的甘蔗病害，其主要传播途径是在种苗或种茎带有带甘蔗黑穗病或甘蔗黑粉菌，甘蔗黑粉菌在存放和种植过程中扩散传染。因此，在甘蔗引种检疫过程中进行甘蔗黑粉菌检测方法是防止甘蔗黑穗病广泛传播的重要途径。甘蔗黑粉菌常规PCR检测方法如专利“甘蔗黑穗病菌快速检测方法”(申请号 201010230534)，这种常规PCR检测方法主要包括以下步骤步骤1，采用CTAB法提取甘蔗黑粉菌基因组DNA ；步骤2，以甘蔗黑粉菌基因组DNA为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS3和ITS4进行PCR扩增；步骤3，对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析。 这种方法虽然也能检测出甘蔗是否感染黑穗病菌，但因其使用的是真菌ITS通用引物，而不是甘蔗黑粉菌特异性引物，其检测特异性极差，在检测过程中很容易受到其他病菌的干扰；灵敏度有限，在黑穗病菌感染量小时无法准确检测出。基于上述方法的不足，本发明根据甘蔗黑穗病菌与同属其它种的ITS区域(基因转录间隔区)碱基组成差异而设计特异性引物，采用巢式PCR对甘蔗黑穗病菌进行检测，检测准确性、灵敏度较高，国内外均未有报道。
发明内容
本发明目的是提出一种甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，其具有特异性强， 灵敏度高的特点，有效提高了检测甘蔗黑穗病菌的准确度。本发明的目的可通过以下技术方案来实现 甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，包括以下步骤
步骤A、基因组DNA提取采用CTAB法提取甘蔗叶片或甘蔗黑穗病菌基因组DNA ； 步骤B、第一轮PCR扩增以步骤A得到的样品为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物； 引物序列号ITS4 5~ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3~ ； ITS5 :5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3“；
PCR反应体系基因组DNA 1 μ L，Taq酶0. 2μ L(5U/y L)，10 XPCR反应缓冲液(含Mg2+) 2. 5 μ L，各 2. 5mmol/LdNTP 混合液 2 μ L，5 μ mol/L 的 ITS4 引物 1 μ L, 5 μ mol/L 的 ITS5 引物1 μ L，灭菌超纯水补足至25yL;
PCR 扩增程序预变性 94°C，5min ；30 次循环 94°C，30s — 56°C，40s — 72°C, Imin ；延伸反应72°C，10min ；保存4°C ；
步骤C、第二轮PCR扩增以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用甘蔗黑粉菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-Ll和Smut-R2经过PCR 扩增得到第二轮PCR扩增产物，引物序列号Smut-Ll 5~- CTAGGGCGGTGTTCAGAAGCAC ； Smut-R2 5~- CAGTGCACGAAAGTACCTGTGG ；
PCR反应体系取IyL第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液作为模板，取 5 μ mol/L 的 Smut-Ll 引物和 5 μ mol/L 的 Smut_R2 引物各 IyL, Taq 酶 0. 2 μ L(5U/ μ L)，10 X PCR反应缓冲液(含Mg2+) 2. 5 μ L，各2. 5mmol/L dNTPs混合液2 μ L，灭菌超纯水补足至25yL ；
PCR扩增程序同步骤B的反应程序；
步骤D、PCR扩增产物检测采用凝胶电泳方法对经步骤C得到的PCR扩增产物进行分析。本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步
1、本发明检测灵敏度极高，最低检测量为2ag甘蔗黑粉菌基因组DNA，较甘蔗黑粉菌常规PCR检测方法的灵敏度提高一万至十万倍，即使在甘蔗无黑穗病症状或者感染黑粉菌量极少时也能准确检测出黑穗病菌；
2、本发明针对性的检测出甘蔗黑粉菌基因组DNA能扩增出大小为530bp的单一目的片段，特异性强，不会检测出镰刀菌、玉米黑粉菌、甘蔗宿根矮化病菌及甘蔗基因组DNA，受其他菌类干扰小，准确率高；
3、本发明还具有耗时短、检测速度快的特点，适用于甘蔗引种检疫、脱毒种苗质量检测及甘蔗黑穗病抗性鉴定早期无症状叶片检测等。
图1是本发明的实施例的凝胶电泳结果图。
具体实施例方式下面用实施例对本发明作进一步说明。 实施例甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，包括以下步骤 步骤A、基因组DNA提取
2011年4月随机采集人工接种甘蔗黑穗病菌冬孢子的甘蔗品种新台糖22号小苗心叶 9片(无甘蔗黑穗病早期症状)，采用CTAB法对每片小苗心叶进行甘蔗黑粉菌基因组DNA提取，得到样品并依次编号为样品4 12 ； 步骤B、第一轮PCR扩增
分别以样品4 12为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和 ITS5经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；
引物序列为ITS4 :5~-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3~ ； ITS5 5~- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3“；
PCR反应体系基因组DNA IyL, 5 μ mol/L的ITS4和ITS5引物各1 μ L，Taq酶 0. 2μ L(5U/y L)，10XPCR 反应缓冲液(含 Mg2+)2. 5μ L，各 2. 5mmol/L 的 dNIPs 混合液 2 μ L， 使用灭菌超纯水补足至总体积25 μ L ；PCR 扩增程序预变性 94°C、5min ；30 次循环 94°C，30s — 56°C，40s — 72°C, Imin ；延伸反应72°C，10min ； 4°C保存; 步骤C、第二轮PCR扩增
以步骤B第一轮PCR扩增产物为模板，采用甘蔗黑粉菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-Ll和Smut-R2经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物； 引物序列号=Smut-Ll 5~- CTAGGGCGGTGTTCAGAAGCAC ， Smut-R2 5~- CAGTGCACGAAAGTACCTGTGG ；
上述引物是根据甘蔗黑穗病菌的DNA基因转录间隔区(ITS)序列进行设计，由上海生物工程有限公司合成并提供；
PCR反应体系是模板一第一轮PCR扩增产物1 μ L，引物一5 μ mol/L的Smut-Ll和 5ymol/L 的 Smut_R2 各 1 μ L，Taq 酶 0. 2 μ L (5U/μ L)，10 XPCR 反应缓冲液(含 Mg2+) 2. 5 μ L，各2. 5mmol/L的dNIPs混合液2 μ L，使用灭菌超纯水补足至总体积25 μ L ； PCR扩增程序与步骤B相同； 步骤D、PCR扩增产物检测
取经步骤C第二轮PCR扩增的产物8 μ L，加入6 X Loading buffer 2. 5yL，在1. 的琼酯糖胶上电泳(加入EB替代物)，凝胶成像系统拍照得到图1。本实施例中，以清水为空白对照，标记为样品1 ；以甘蔗黑粉菌基因组DNA为阳性对照，标记为样品2 ；以甘蔗无病种苗基因组DNA为阴性对照，标记为样品3。根据图1中目的片段(530bp)的有无判断检测结果，结果显示样品4、5、6、8、9、 10,11,12为阳性，检测出甘蔗黑粉菌；只有样品7为阴性，未检测出甘蔗黑粉菌。
权利要求
1.甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，其特征在于包括以下步骤 步骤A、基因组DNA提取采用CTAB法提取甘蔗叶片或甘蔗黑穗病菌基因组DNA ； 步骤B、第一轮PCR扩增以步骤A得到的DNA样品为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物； 引物序列号ITS4 5~ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3~ ； ITS5 :5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3“；PCR反应体系基因组DNA lyL，Taq酶0. 2yL (5U/μ L)，10XPCR反应缓冲液(含 Mg2+) 2. 5μ L，各 2. 5mmol/L dNTPs 混合液 2 μ L，5 μ mol/L 的 ITS4 引物 1 μ L, 5ymol/L 的ITS5引物lyL，灭菌超纯水补足至25yL;PCR 扩增程序预变性 94°C，5min ；30 次循环 94°C，30s — 56°C，40s — 72°C，Imin ；延伸反应72°C，IOmin；保存4°C ；步骤C、第二轮PCR扩增以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用甘蔗黑粉菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-Ll和Smut-R2经过PCR 扩增得到第二轮PCR扩增产物，引物序列号=Smut-Ll 5~- CTAGGGCGGTGTTCAGAAGCAC ； Smut-R2 5- CAGTGCACGAAAGTACCTGTGG ；PCR反应体系取IyL第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液作为模板，取 5 μ mol/L 的 Smut-Ll 引物和 5 μ mol/L 的 Smut_R2 引物各 IyL, Taq 酶 0. 2 μ L(5U/ μ L)，10 X PCR反应缓冲液(含Mg2+)2. 5 μ L，各2. 5mmol/L dNTPs混合液2 μ L，灭菌超纯水补足至25yL ；PCR扩增程序同步骤B的反应程序；步骤D、PCR扩增产物检测采用凝胶电泳方法对经步骤C得到的PCR扩增产物进行分析。
全文摘要
本发明涉及甘蔗病原菌检测领域，提出甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，包括基因组DNA提取、第一轮PCR扩增、第二轮PCR扩增、PCR扩增产物检测步骤，其中第一轮PCR扩增中采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5，第二轮PCR扩增中采用甘蔗黑粉菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-L1和Smut-R2，本发明的实质性特点有1、检测灵敏度极高，即使在甘蔗无黑穗病症状或者感染黑粉菌量极少时也能准确检测出黑穗病菌。2、特异性强，受其他菌类干扰小，准确率高。3、具有耗时短、检测速度快的特点，适用于甘蔗引种检疫、脱毒种苗质量检测及甘蔗黑穗病抗性鉴定早期无症状叶片检测等。
文档编号C12Q1/04GK102329858SQ20111021858
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者习平根, 刘睿, 姜子德, 李敏慧, 杨湛端, 沈万宽, 邓海华, 陈仲华, 陈健文 申请人:华南农业大学, 广州甘蔗糖业研究所