专利名称：一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法
技术领域：
本发明涉及动 物生殖生理与生物技术领域。具体涉及牛体细胞核移植中供体细胞的选择方法。
背景技术：
目前核移植的效率平均不到10%。体细胞核移植效率的提高，有赖于各环节的进一步完善，而供体细胞的准备是核移植关键的一步。供体细胞的来源和种类，不同发育阶段的供体核，以及供体细胞体外培养的代数和供体细胞来自个体的年龄等的不同，其核移植效果都存在着很大差异。当前一些研究是从细胞的代数上进行选择，研究结果尚无定论(高国龙，牛体细胞克隆中供体和受体细胞制备及重构胚构建的影响因素研究；博士论文，2007)，但是在目前很多核移植研究中，大多数使用的是传代次数较少的细胞，一般为4-6代，很多学者认为这类细胞利于核移植胚的发育。在注入受体细胞前，供体细胞的体外传代培养，极有可能造成遗传损伤。所以，研究者们一般采用短期培养的细胞(10代以内)做核供体，不过也有例夕卜，Kubota等用成年牛体细胞传至10和15代的细胞进行克隆的重构胚发育率比传5代的高，并且只有传至10和15代的细胞进行克隆得到了克隆牛犊。这个明显不同的研究结果可能是与供体动物年龄和供体细胞体外培养的时间长短有很大关系，也可能是由于不同细胞系在分化过程中上产生竞争的差异引起的。但理论倾向于原代细胞(十代以内)作为核供体较好。还有些研究是从细胞的来源上进行选择，如牛的卵丘细胞，输卵管上皮细胞跟成纤维细胞比较前两者克隆囊胚率较高(Kato Y, et al. Eight calves cloned from somaticcells of a single adult. Science，1998，282 :2095. Kato Y，et al. Cloning of calvesfrom various somatic cell types of male and female adult，new born and fetalcows. J Reprod Fertil, 2000,120 :231)，但是材料的获得会涉及动物的屠宰或对动物体伤害较大的手术，在科技日益发达和动物福利日益提高的今天，我们并不提倡用前两种材料。用牛耳组织成纤维细胞，不但对牛的伤害较小，改善细胞培养技术后还可相应的提高克隆形成率，是值得推广的技术。活性氧(Reactive Oxygen Species, R0S)又被称为三原子氧,是在自然界普遍存在的，它是氧的代谢产物和一些氧化还原反应产生的含氧物质的总称(Kalghatgi,Fridmanet al，2009)。生物体内的ROS可通过机体酶系统和非酶系统产生的内源性活性氧，也可来自环境的外源性活性氧。体内ROS可在很多反应过程中产生(Miranda, Purdie et al.)。在有机体组织的正常氧化代谢过程中产生的R0S，通常通过组织内部的防御机制来维持平衡。但是在一些损伤因素的作用下，细胞中抗氧化保护机制不足时，细胞内的氧化代谢物增加，使ROS产生堆积并对细胞产生毒性。在体外培养的情况下，我们可以人为的加入一定量的抗氧化剂(Antioxidants),使细胞免于氧化应激和一些可控制的氧化损伤,使细胞保持更强的活力，更好的传代培养，以供我们的后续研究。
目前研究中所用的抗氧化剂主要分为两类酶类抗氧化剂主要包括超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、牛磺酸、亚牛磺酸等和非酶类抗氧化剂主要包括维生素C(VC)、维生素E(VE)、β-巯基乙醇(2-巯基乙醇，β -mercaptoethanol, β -ME),氮-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine),谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、裡黑素(Melatonin, MLT)、类胡萝卜素(Carotenoid)、α -硫辛酸(a -Lipoic acid)、微量兀素铜、 锋、硒(Se)等(Sakamoto, Munemura et al, 2008) 有研究证实，在体外培养动物体细胞时，在培养过程中添加抗氧化剂能够提高细胞的抗氧化能力。Zhou等考察了抗氧化剂对鼠角质细胞体外培养寿命的影响。试验发现在角质细胞的体外培养过程中添加抗氧化剂有利于延长细胞的寿命，其中效果最好的是巯基乙醇，其次为CAT和S0D，试验还发现，添加抗氧化剂可在一定程度上提高角质细胞的克隆形成率，减缓细胞衰老速率，利于细胞的生长(Zhou T et al，2002)。而将β-巯基乙醇用于牛供体细胞的培养现在还未发现。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，建立新的方法筛选牛核移植供体细胞，提高供体细胞的活力，从而提高体细胞核移植的效率。本发明利用接种法培养牛耳组织成纤维细胞，挑选细胞活力最强的第六代细胞进行β -巯基乙醇的不同浓度梯度处理，选择活力和抗氧化能力最强100 μ mol/L β-巯基乙醇处理的细胞进行核移植，检测胚胎的卵裂率和囊胚率。本发明通过以下技术方案实现一种利用抗氧化剂筛选核移植供体细胞的方法，其步骤如下I)剪取牛耳尖端4_5cm2的组织，利用接种法培养得到牛耳组织成纤维细胞；2)在步骤I)的细胞传至2、6、13、20代时分别测定细胞活力(MTT OD值)；3)挑选细胞活力较强，即MTT OD值为O. 609±0. 053的第六代的细胞，备用；4)用浓度为100 μ mol/L的β -巯基乙醇处理步骤3)所得细胞培养24h的细胞作为供体细胞；5)取牛卵母细胞在成熟培养液中培养至成熟,备用；6)将步骤5)的牛卵母细胞作为受体，进行核移植，观察并记录重构胚的卵裂率和囊胚率；其中上述试剂的组分及配制方法如下细胞培养液-I和细胞培养液-2 ；细胞培养液-I :胎牛血清10ml，青霉素-链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至IOOml ；细胞培养液-2 :胎牛血清20ml，青霉素-链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至IOOml ；抗氧化剂培养液向细胞培养液-I中添加巯基乙醇，其浓度分别为O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L,过滤除菌，4°C下保存；成熟培养液TCM199(购自Gibco公司，下同)26ml ;胎牛血清3. Oml ;促卵泡激素15 μ g ;促黄体素150ng ;雌二醇30 μ g ;表皮生长因子150ng ;丙酮酸钠6. 6mg ;青霉素_链霉素抗菌液O. 3ml ;过滤灭菌，4°C下保存；胚胎培养液肌醇O. 015g;必须氨基酸900 μ I ;非必需氨基酸300 μ I ;牛血清白蛋白0.09g ;青霉素-链霉素抗菌液300 μ I ;丙酮酸盐600 μ I ；Stock G30 μ I ；StockC28ml ;过滤灭菌，4 °C下保存；各种盐溶液的配制Stock A NaCll. 267g ；KC10. 107g ；KH2PO4O. 032g ；MgS04 · 7H200. 036g ;青霉素-链霉素抗菌液 O. 2ml ;Na_LactateO. 12ml ；H2019. 5ml ；Stock B =NaHCO3O. 21g ；H2OIOml ；Stock D =CaCl2 · 2H200. 262g ；H2OIOml ；Stock G :L_GlucoseO. 292g ；H2010ml ；Stock C STOCK Al. Iml ；STOCK BI. 0ml ；STOCK DO. Iml ；H207. 9ml。本发明的有益效果是本发明对现有技术的贡献主要体现在以下几个方面本发明利用不同浓度的抗氧化剂处理供体细胞，直接检测细胞的抗氧化能力，来对细胞进行筛选，避免了核移植显微注射过程中选择供体细胞的盲目性。本发明选择活力最为旺盛，增殖最为迅速的第六代细胞进行处理再细胞核移植，避免了细胞代数选择的盲目性，节省了时间和资源。·
本发明得到β -巯基乙醇处理牛供体细胞的的最佳浓度为100 μ mol/L,此浓度处理的供体细胞的抗氧化能力最强，活力最高，用这种细胞进行核移植，可为重构胚更好的发育提供基础。样品采集后，可在4摄氏度冰箱中短期保存，给试验者提供了足够的准备时间，降低了试验者的压力，也提高了试验的成功率。本发明可在不对动物体造成巨大伤害的情况下应用，成纤维细胞材料只需剪去牛耳尖少部分组织即可，剪取组织后，可用抗生素对牛进行静脉注射，和对伤口进行处理，来降低伤口感染的几率。对牛的应激也比非常小，响应了社会对提高动物福利的呼吁。目前大部分核移植选取的供体细胞是从屠宰后的个体取得的，个体死亡后细胞的活力有相应的降低，再经过长时间的试验过程，细胞的活力会明显的下降，核移植效果就会受到影响。本发明可进行活体采样，在对个体不产生大的应激的情况下，提高核移植的效率。
图I :是本发明的技术路线。图2 :是第I代牛耳组织成纤维细胞。图3 :是第6代牛耳组织成纤维细胞。图4 :是第13代牛耳组织成纤维细胞。图5 :是第20代牛耳组织成纤维细胞。图6 :处于卵裂期的牛克隆胚胎(X 100)。图7 :处于囊胚期的牛克隆胚胎(X200)。
具体实施例方式I、供体细胞的培养和核移植I)采样用75%的酒精擦洗牛耳尖端4-5cm2的组织，用眼科剪刀剪取组织，用75%的酒精冲洗组织三遍，再用含有双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三遍，放入细胞培养液-I中，得到牛耳组织样品；2)接种法培养牛耳成纤维细胞将所述的牛耳组织样品分别用75%酒精和1%双抗的PBS冲洗三次，置玻璃皿中，剔除毛发和表皮，用眼科剪剥取其真皮组织，用含I %双抗的PBS充分冲洗后剪至Imm3左右的小组织块,置于细胞培养液_1中，于800r/min离心3min,反复洗涤6-8次；加入少量细胞培养液_2，将离心洗涤后的组织块均匀铺于培养皿底部，吸出多余培养液，置于37. 5°C，5% CO2饱和湿度的培养箱中孵育；孵育时间为8-12h ;再加入细胞培养液-22. 5-3ml，每隔两天更换新鲜的细胞培养液-2 —次；
3)传代观察培养皿中组织块边缘是否有细胞长出，当细胞长满皿底95%以上时，剔除组织块；用胰蛋白酶消化细胞3-5min，观察细胞是否变圆，并漂浮于培养液中，力口入含细胞培养液-I终止消化，1200r/min离心5min，重复离心两次，将一个培养皿的细胞转移至两个新的培养皿中；4)在细胞传至2、6、13、20代时分别测定细胞活力，即MTT-OD值测定；5)挑选细胞活力最强(MTT-0D值为O. 609 ±O. 053)的第六代细胞，备用；6)分别用含有 O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L β -疏基乙醇(β -ME)的细胞培养液培养24小时，然后测定细胞的MTT-OD值和抗氧化指标，即测定细胞中总谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dimutese, S0D)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、丙二醒(Malondialdehyde,MDA)和总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity, T-A0C),计 5 个指标(GSH-Px、SOD、CAT为细胞内的三种抗氧化酶，T-AOC为细胞内总的抗氧化能力，这四种指标的高低能够直接反应细胞的抗氧化能力的高低；机体产生的氧自由基能够引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，脂质过氧化最终产物MDA的量可反映机体内脂质过氧化强弱，进而间接的反应细胞损伤程度)；7)选择细胞活力和抗氧化力最强的100 μ mol/L的β -巯基乙醇处理24h的细胞使用含0. 5%胎牛血清的DMEM饥饿处理，同时将第六代细胞做同样的饥饿处理，均作为供体细胞，备用；8)卵母细胞的制备将离体卵巢迅速放入37°C PBS中，用75%的酒精泡lmin，再用含有双抗的PBS冲洗3 4次，之后用带有12#针头的IOml —次性注射器从大小为2_8mm卵泡中吸取卵丘卵母细胞复合物(COCs)放入成熟培养微滴中成熟培养，每100 μ I成熟培养微滴中含20-25个卵母细胞，培养皿放入38. 5°C>5% CO2和相对饱和湿度条件的培养箱中培养22-24h至成熟，备用；9)将上述的牛卵母细胞作为受体，进行核移植，设计了以下三个试验第一组将第六代牛耳组织成纤维细胞为供体进行核移植；第二组(单处理组)将第六代牛耳组织成纤维细胞为供体进行核移植，重构胚用100 μ mol/L胚胎培养液培养；第三组(双处理组)将第六代牛耳组织成纤维细胞作为供体进行核移植，得到重构胚。重构胚用ΙΟΟμπιοΙ/L^-ME的胚胎培养液培养。观察并记录重构胚的卵裂率和囊胚率；10)核移植将体外成熟培养的COCs转入含O. I %浓度的透明质酸酶的成熟培养液中消化5分钟，再用移液枪反复吹打，之后用成熟培养液(OMM)洗2-3次，尽量去掉卵丘细胞，随后放在体视显微镜下挑选包含第一极体的卵母细胞作为受体，之后将其放入含5 μ g/ml细胞松弛素的新鲜配制的OMM的操作液微滴中，其上覆盖矿物油平衡10-15min，在显微操作仪下，用去核针去除第一极体及附近的胞质，放在5 μ g/ml Hoechst 33342染色液中检测去核效果，将去核完全的受体卵母细胞的卵周隙内用注核针吸入边缘光滑、胞质均匀的步骤8中的供体细胞，形成重组胚；重组胚转移到成熟培养液中修复2-3h ；11)修复后的重组胚在含5 μ mol/L离子霉素的成熟培养液中培养5min，再用培养液洗2-3遍，然后将其放入含2mmol/L 6- 二甲氨基吡啶的SOF胚胎培养液中孵育4h，再冲洗2-3次之后，第二组和第三组转移到含β -巯基乙醇100 μ mol/L的胚胎培养液微滴中，第一组转移到不含β -巯基乙醇的SOF胚胎培养液微滴中，置38. 5°C>5% CO2和相对饱和湿度条件的培养箱中，每48h换一次液，72h后加入10%胎牛血清继续培养，观察并记录胚·胎发育情况；其中上述各试剂的配制细胞培养液-I和细胞培养液-2的配制细胞培养液-I (10% DMEM):胎牛血清10ml，Iml青霉素-链霉素抗菌液(简称双抗，P/S)，用杜贝柯氏最小必需培养液(DMEM)定容至IOOml ；细胞培养液-2 (20% DMEM):胎牛血清20ml，Iml青霉素-链霉素抗菌液(简称双抗，P/S)，用杜贝柯氏最小必需培养液(DMEM)定容至IOOml ；抗氧化剂培养液向细胞培养液-I中添加巯基乙醇(β-ΜΕ)，其浓度分别为O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L,过滤除菌，4°C下保存；磷酸盐缓冲液(PBS)NACL 8. 00g/L ；KCL 0. 20g/L ；KH2PO4 0. 20g/L ；NA2HPO4
I.15g/L ;用超纯水溶解,灭菌后常温保存；成熟培养液(OocyteMature Medium, 0MM,以 30ml 为例):TCM199(购自 Gibco公司)26ml ;胎牛血清(FBS) 3. Oml ;促卵泡激素(FSH) 15 μ g ;促黄体素(LH)150ng;雌二醇30yg(E2);表皮生长因子150ng;丙酮酸钠6.6mg，青霉素-链霉素抗菌液(双抗，P/
S)0. 3m ;过滤灭菌，4°C下保存；SOF胚胎培养液肌醇0.015g ;必须氨基酸900 μ 1+ ;非必需氨基酸300 μ I ;牛血清白蛋白出3六)0.098;30(^1青霉素-链霉素抗菌液(双抗，P/S)300y I ;丙酮酸盐600 μ I ；Stock G30 μ I ；Stock C28ml ;过滤灭菌，4°C下保存；各种盐溶液的配制Stock A NaCll. 267g ；KC10. 107g ；KH2PO4O. 032g ；MgS04 · 7H200. 036g ;青霉素-链霉素抗菌液 0. 2ml ;Na_Lactate0. 12ml ；H2019. 5ml ；Stock B =NaHCO3O. 21g ；H2010ml ；Stock D =CaCl2 · 2H200. 262g ；H2010ml ；Stock G :L_Glucose0. 292g ；H2010ml ；
Stock C STOCK Al. Iml ；STOCK BI. Oml ；STOCK DO. Iml ；H207. 9ml。2、不同代次细胞活力的测定MTT分析法，活细胞的线粒体中存在与NADPH相关的脱氢酶，可将黄色MTT还原为不溶性的蓝紫色的结晶甲臢(Formazan)，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解甲臢后可用酶标仪在490nm波长处检测光密度。收集对数期生长的细胞，调整细胞悬液浓度为5. OX IO4个/ml，每孔加入IOOul，使待测细胞调密度为5000个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。5% C02，37. 5°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，每孔加入20 μ IMTT溶液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μ I 二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光值。得到如表I所示的数据 表I β -ME处理前的细胞MTTOD值比较
代次261320
MTTOD0.591±0.030a0.609±0.053a0.590±0.022a0.221±0.032b注同行肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0. 05)从表I我们可以看出，牛第20代和2,6,13之间差异都极显著(P < 0. 01)，第2，6，13代之间差异不显著(P >0.05)。YCF第2和6代次之间差异显著(P < 0. 05)，第20和2，6，13代之间差异极显著(P <0.01)。总结第六代细胞活力最为旺盛，增殖最为迅速，为使核移植效率达到最高，又不浪费时间和资源的情况下，我们就可以对第六代细胞进行处理后再细胞核移植。3、不同浓度β-ME处理后供体细胞活力的测定得到如表2所示的数据表2用不同浓度β -ME处理后细胞的MTT-OD值比较
β-ΜΕOpmol/L50pmol/L100pmo]/L150μηιο1/
MTT(OD)0.632±0.034a0.817±0.013b0.941±0.028°0.910±0.061d注同行肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0. 05)从表2可以看出，在β-ΜΕ浓度为100 μ mol/L时，细胞的OD值最高，且细胞的四种处理之间差异均显著(P < 0. 05)。说明添加β -ΜΕ，可以明显提高细胞的活性(P < 0. 05)，有利于细胞的增殖，降低了细胞的凋亡率，用100 μ mol/L的β-ΜΕ处理最为合适，既提高了细胞的活性，又避免了 β -ME可能对细胞产生的毒性。3、不同浓度β -ME处理后供体细胞抗氧化指标的测定去除细胞培养液后，加入3ml0. 5% Triton的Tirs-HCL溶液，在室温下溶解细胞30分钟，收集细胞裂解液，置于-20°C冰箱中保存，用于测定细胞中总谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dimutese, S0D)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、丙二醒(Malondialdehyde, MDA)和总抗氧化能力(TotalAntioxidant Capacity, T-AOC),计5个指标。试剂盒购自南京建成生物工程研究所,具体操作步骤按照说明书进行，测定数据按照说明书计算得出，试验设3个重复。得到如表3所示的数据表3不同浓度β-ΜΕ处理后细胞的抗氧化指标比较
权利要求
1. 一种筛选牛核移植供体细胞的方法，其特征在于以下步骤 1)剪取牛耳尖端4-5cm2的组织，利用接种法培养得到牛耳组织成纤维细胞； 2)在步骤I)的细胞传至2、6、13、20代时分别测定细胞活力，即MTTOD值； 3)挑选细胞活力OD值为O.609±0. 053的第六代的细胞，备用； 4)用浓度为100μ mol/L的β -巯基乙醇处理步骤所得的细胞24h的细胞作为供体细胞； 5)取牛卵母细胞在成熟培养液中培养至成熟，备用； 6)将步骤5)的牛卵母细胞作为受体，进行核移植，观察并记录重构胚的卵裂率和囊胚率; 其中 上述试剂的组分及配制方法如下 细胞培养液-I和细胞培养液-2 ； 细胞培养液-I :胎牛血清10ml，青霉素-链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至IOOml ； 细胞培养液-2 :胎牛血清20ml，青霉素-链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至IOOml ； 抗氧化剂培养液向细胞培养液-I中添加巯基乙醇，其浓度分别为O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、和 150 μ mol/L,过滤除菌，4°C下保存； 成熟培养液TCM199 26ml ;胎牛血清3. Oml ;促卵泡激素15 μ g ;促黄体素150ng ;雌二醇30 μ g ;表皮生长因子150ng ;丙酮酸钠6. 6mg ;青霉素-链霉素抗菌液0. 3ml ;过滤灭菌，4°C下保存； 胚胎培养液肌醇0.015g ;必须氨基酸900 μ I ;非必需氨基酸300 μ I ;牛血清白蛋白0.09g ;青霉素-链霉素抗菌液300 μ I ;丙酮酸盐600 μ I ；Stock G30 μ I ；Stock C28ml ;过滤灭菌，4°C下保存； 各种盐溶液的配制Stock A NaCll. 267g ；KC10. 107g ；KH2PO4O. 032g ；MgS04 · 7H200. 036g ;青霉素-链霉素抗菌液 0. 2ml ；Na-Lactate0. 12ml ；H2019. 5ml ；Stock B =NaHCO3O. 21g ；H2010ml ；Stock D =CaCl2 · 2H200. 262g ；H2010ml ；Stock G L-Glucose0. 292g ；H2010ml ；Stock C STOCK AL Iml ；STOCK BI. 0ml ；STOCK DO. Iml ；H207. 9ml。
全文摘要
本发明涉及动物生殖和分子生物学操作技术领域。具体涉及牛体细胞核移植中供体细胞的选择方法。公开了一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法。为了提高牛核移植效率中的供体细胞的数量，本发明利用活体采样，接种法培养细胞，稳定传代的活力为OD值为0.609±0.053的第六代细胞，用浓度为100μmol/L的β-巯基乙醇处理细胞24h后的细胞作为供体细胞，为重构胚更好的发育奠定了基础。
文档编号C12N5/071GK102899353SQ20111021895
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月30日 优先权日2011年7月30日
发明者易建明, 赵玲玲, 宋海泉, 杨利国, 陶林林 申请人:华中农业大学