专利名称：适配子型生物芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于临床检测技术领域，特别涉及一种适配子型生物芯片及其制备方法
和应用。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成、蛋白质组计划的启动，基因序列数据及蛋白质序 列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而怎样去研究如此众多基因及蛋白质在生 命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题，生物芯片(biochip)正 是在这样的背景下应运而生的。生物芯片技术是融合微电子学、生物学、物理学、化 学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有茧大的棊础研究价值，又具有良好的 产业化前景。生物芯片是指通过微加丁技术，将生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至 组织切片、细胞等生物样品有序地固化f支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品 中的靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦显微扫描仪或电荷偶联摄影像机(ch紅ge couple device, CCD)等对杂交信号的强度进行快速、并行、卨'效的检测，再经计算机分 析数据和处理结果，从而获得相关的生物信息。由T生物芯片可将极其大量的探针M时 固定于固相支持物匕所以可一次对大量的生物分子进行检测分析，从而解决传统生物 学分析方法技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、通量低等不足。
目前，临床上在对标本屮靶分子进行生物芯片检测时，通常都是在芯片基片....匕 同定DNA探针(基因芯片)或蛋0抗体(免疫芯片)。但DNA探针或抗体在检测过程中 都存在着特异性差及检测灵敏度低的问题。 传统的基因芯片表面固定的大都是DNA探针，这带来了两个严重的"瓶颈"问 题 一是检测灵敏度不够a，探针一般长2()个碱基左右，在与较长的靶序列杂交时，存 在着结合力不够高的问题。二是特异性不强，经常有碱基错配的序列与之发生非特异性 杂交。这两大问题使基冈芯片在进行临床标木检测时需要预先经PCR扩增，操作繁琐的 同时也影响了检测的特异性和稳定性，且存在假阳性结果的问题，从而人人降低了其实
)i:]性，无法满足进行:,:接检测的要求。国内外学者对如何避开PCR:有接对核酸分子进行
检领 ，都进行了系统的相关研究。'"学者提出采用PNA探针取代传统的DNA探针，PNA 探针是一种人工合成的DNA模拟物，其与靶序列杂交的稳定性和亲和力都高f DNA探 针，但PNA作为一种新型探针合成成本非常高，同时目甜只研究设计出针对几种有限靶 序列的PNA探针，这使得PNA探针的应用受到了极大的限制。 单克隆抗体则存在难以区分结构类似物或交叉抗原的问题，检测特异性差从而 影响检测结果；另外其检测灵敏度也较低，不能令使用者满意。 因此解决当前生物芯片技术所存在的问题，研制新型的生物芯片就显得尤为重 要。
发明内容
本发明的目的在于提供-一种适配子型生物芯片，以克服传统生物芯片技术检测 特异性差、灵敏度低的缺陷；同时还进一步提供了所述芯片的制备方法和应用。
本发明采用的技术方案如下 适配子型生物芯片，包括芯片基片，所述芯片基片的上表面和/或下表面分别镀 有金或银膜电极S，其中-'个表面的金或银膜电极S上固定有适配子分子S。
所述的金或银膜电极层厚度为50-300nm。 所述的芯片基片可以为玻璃、石英晶体、金属、膜、硅片或有机聚合物。 本发明通过固定于芯片基片金或银膜电极层....匕的适配子分子来实现有接、准
确、灵敏地检测标本中的靶分子。 因为适配了是经过层层筛选，且与配体高度特异结合的，因此适配了可以做为 抗休的杼代品，H.适配子为核苷酸序列，所以比较抗休优势很明显，合成简单、廉价、 稳定性好。由于适配子分子与靶分子的结合具有a灵敏度、卨特异性的特点，因此基于 适配子-靶分子生物识别原理的适配子型生物芯片与以往的生物芯片相比，具有高效、 准确、灵敏度高等显著特点。同时由于适配子分子生物学性质稳定，易于长时间保存， 可以耐受反复的变性和复性，因此既可在常温下存储和运输，又可耐受反复再生多次使 用，具备经济简便的优点。对于核酸分子的检测，由于适配子分子体积小，可以在芯片 表面高密度同定，因此具:f.l-较低的检测限，可以避免以往核酸分子检测过程中的多聚酶 链式反应扩增，简化了操作步骤的同时提高了结果的准确性；ttlf适配了及其延K臂序 列只要通过化学合成和修饰就可以得到，目前DNA合成技术已经非常成熟，因此合成成 本极低；通过SELEX技术，可在l个月内得到与冃标分子卨度特异结合的适配子，因此 新产品研发周期短。 所述的适配子型生物芯片可按照以下方法进行制备 根据目标检测分子，筛选其对应的适配子分子；在芯片基片的上表面和/或下表 面制备金或银膜电极S;并将适配子分子固定于其屮一个表面的金或银膜电极S表面， 即制备得到所述适配子型生物芯片。 具体的制备过程，可以采用离了溅射镀膜法制备金或银膜电极层。
所述的金或银膜电极层厚度为50-300nm。 所述的固定可以采用物理吸附、分子自组装或生物素-亲和素结合等方法将适配 子分子固定丁'金或银膜电极S表面；其他可以将适配子分子固定丁-电极S表面的任何物 理或者/和化学的方法都是可以的。 所述的目标检测靶分子可以为蛋白、核酸、金属离子、有机染料、氨基酸、抗 生素、核苷、肽、完整的病毒颗粒或细胞混和物。 与所述的g标检测分子相对应的适配子分子的筛选，本领域技术人员可通过 SELEX技术进行。 所述的适配子型牛物芯片在具休应用时，将适配子型牛物芯片放入相应牛物传 感器的检测装置中，将待测标本滴加在适配子分子层表面，获取检测数据。
所述生物传感器包括激光扫描、压电生物传感器或表面等离子体共振传感器 (SPR)等，各种利用生物芯片检测形式的生物传感器都可以使用。
应W非常.宵接、简便，避免了传统方法扩增等繁琐、费时的步骤。
本发明相对于现'Y]技术，丫/以下优点 本发明适配了型生物芯片具有高效、准确、灵敏度高等显著特点，nj为临床诊 断提供更为精确的检测信息；可以耐受反复再牛多次使用，H.运输保存条件简单，检测 成本更加低廉；生产成本低；新产品研发周期短；制备方法简单易于操作；更符合临床 检测的实P'J、需贷，适合我国的国情及医疗现状。
图1是本发明实施例1所述的适配子型生物芯片的结构示意图；
图2是本发明实施例2所述的适配子型生物芯片的结构示意图。
具体实施例方式以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此
实施例1 适配子型生物芯片，如图1所示，包括芯片基片l，所述芯片基片的i:表面和——F 表面分别镀有金膜电极层2和4，厚度为150nm，上表面的电极层2上固定有适配子分子 S3。 所述的芯片基片为石英晶体，所述的人免疫球蛋O E适配子分子序列为 5'' -GGGGCACGTT-TATCCGTCCCTCCT AGTGGCGTGCCCC 3''。 所述芯片可用以检测人免疫球蛋白E(Ig:E)分子，筛选其对应的适配子分子；在 芯片基片的--匕表面和下表面采用离子溅射镀膜技术镀制金膜电极层；采用生物素-亲和素 结合方法将适配子分子固定丁'上表面的电极S表面，即制备得到人免疫球蛋白:E适配子 型生物芯片。 利用所述芯片检测人免疫球蛋白E标本将所制备的人免疫球蛋白E适配子 型生物芯片放入相应的压电生物传感器检测装背屮，将待测标本滴加在适配子分子S表 面，从检测仪上读取检测数据，其结果即频率变化值与待测标本中的IgE浓度相关。
实施例2 适配子型牛物芯片，如图2所示，包括芯片基片i，所述芯片基片的下表面镀有 金膜电极层2，厚度为15()nm，下表面的电极层2上固定有适配子分子层3 ;
所述的芯片基片材料为玻璃棱镜。所述芯片用以检测凝血酶，所述的适配子分 子为抗凝血酶适配子，序列为5' -GGTTGGT-GTGGTTGG 3'。 在棱镜的下表面以离子溅射镀膜法镀制金膜电极层；将适配子分子以生物素"亲
和素方法固定于芯片--F表面的电极S表面，即制备得到抗凝血酶适配子型生物芯片。 利用所述芯片检测人凝血酶将所制备的抗凝血酶适配子型生物芯片放入相应 的表面等离了体共振生物传感器的检测装置中，将待测标本流经适配了分了层表面，从 电荷偶联摄影像机(CCD)上读取检测数据，其检测到的光谱共振波长的位移与待测标本 中的凝血酶浓度相关。
实施例3 适配子型生物芯片，结构同实施例1 ;
所述的芯片某片材料为玻璃。所述芯片ltj以检测亚甲蓝，所述的适配子分子为 抗亚甲蓝适配子，序列为5' -TTC CAA CGG TTG GTG TGG TTG G 3'，采用荧光素标 记。 将适配子分子以原位合成或微量点样技术固定于玻璃芯片的上表面，即制各得 到抗亚甲蓝适配子型生物芯片。利用所述芯片检测亚甲蓝将待测标本滴加在适配子分 子S表面，将所制备的抗亚甲蓝适配子型生物芯片放入相应的杂交仪进行杂交，随后进 行相应的清洗步骤。在激光仪的激发下，利用相应的检测装置，如电荷偶联摄影像机或 激光共焦显微镜读取检测数据，其检测到的荧光信号强度与待测标本中的业甲蓝浓度相 关。 实施例4 适配了型生物芯片，所述芯片基片的上表面和下表面分别镀有银膜电极层，其
他皆同实施例丄。
SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军第三军医大学第-^附属医院<120>适配子型生物芯片及其制备方这和应用<130><160>3<170>Patentln version 3,4<210>1<2丄丄>37<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<4-()0>1ggggcacgtt tatccgtccc tcctogtggc gtgcccc<210>2<2丄丄>丄5<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<4-()0>2ggttggtgtg gttgg<210>3<2丄丄>22<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>人工序列
<400>3ttccaacggt tggtgtggtt gg 2权利要求
适配子型生物芯片，包括芯片基片，其特征在于，所述芯片基片的上表面和/或下表面分别镀有金或银膜电极层，其中一个表面的金或银膜电极层上固定有适配子分子层。
2. 如权利要求1所述的适配子型生物芯片，其特征在于，所述的金或银膜电极层厚度 为50-300nm。
3. 如权利要求1或2所述的适配子型生物芯片，其特征在于，芯片基片为玻璃、石英 晶体、金属、膜、硅片或W机聚合物。
4.权利要求1所述的适配了型生物芯片的制备方法，其特征在f,根据目标检测分 子，筛选其对应的适配子分子；在芯片基片的上表面和/或下表面制备金或银膜电极层； 并将适配子分子固定于其中一个表面的金或银膜电极层表面，即制备得到所述适配子型 生物芯片。
5. 如权利要求4所述的适配子型生物芯片的制备方法，其特征在于，所述的金或银膜 电极层厚度为50-300nm。
6. 如权利要求4所述的适配子型生物芯片的制备力'法，其特征在于，所述的固定为采 用物理吸附、分子自组装或生物素-亲和素结合方法将适配子分子同定于金或银膜电极层 表面。
7. 如权利要求4-6之-一所述的适配子型牛物芯片的制各方法，其特征在于，目标检测 分子为蛋白、核酸、金属离子、有机染料、氨基酸、抗生素、核苷、肽、完整的病毒颗 粒或细胞混和物。
8. 权利要求1所述的适配子型生物芯片的应用，其特征在于，将适配子型生物芯片放 入相应生物传感器的检测装置中，将待测标本滴加在适配子分子层表面，获取目标检测 分子的检测数据。
全文摘要
本发明属于临床检测技术领域，特别涉及一种适配子型生物芯片及其制备方法和应用。所述适配子型生物芯片，包括芯片基片，所述芯片基片的上表面和/或下表面分别镀有金或银膜电极层，其中一个表面的金或银膜电极层上固定有适配子分子层。本发明适配子型生物芯片具有高效、准确、灵敏度高等显著特点，将为临床诊断提供更为精确的检测信息；可以耐受反复再生多次使用，且运输保存条件简单，检测成本更加低廉；生产成本低；新产品研发周期短；制备方法简单易于操作；更符合临床检测的实际需要，适合我国的国情及医疗现状。
文档编号C12Q1/70GK101691610SQ20091016248
公开日2010年4月7日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者姚春艳, 府伟灵, 齐永志 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院