专利名称：一种固体表面修饰空气稳定性磷脂膜的方法
技术领域：
本发明涉及表面化学及应用化学领域，具体地，本发明涉及一种固体表面修饰空 气稳定性磷脂膜的方法。
背景技术：
生物芯片及其应用是目前研究的热点，由于生物分子在芯片表面固定后，往往存 在生物活性会发生降低甚至丧失的可能性；另外芯片表面还常常引起蛋白的非特异性吸 附，这些问题是生物芯片应用中的重要障碍。而生物膜是天然的保持生物分子活性的组成 结构，并且具有防止蛋白吸附的特点；如果采用仿生原理，在生物芯片表面修饰人工生物 膜，即修饰类似生物膜的磷脂膜层，则可提供生物分子保持和发挥生物学活性的环境，同时 还能有效防止其它生物分子的非特异性吸附，因此，磷脂膜在生物芯片等研究领域，具有良 好的应用前景。目前磷脂膜的修饰方法主要有两种，一种是Langmuir-Blodgett/Shaefer法，该 方法在特殊的装置中，利用磷脂分子在气液界面自组装排列成单分子层，然后按一定方式 转移到待修饰固体的表面，形成单分子层或多分子层膜。第二种方法是制备大小均勻的小 单层囊泡(small unilaminar vesicles，SUVs)，囊泡从液相中直接吸附融合到固体基底表 面形成磷脂膜层，这些方法制备的磷脂膜层均需要一直保持在水环境中才能稳定存在，一 旦遇到空气，磷脂膜将从支撑表面剥落，从而给磷脂膜层的实际应用带来了一定影响，尤其 对于一些需要在空气环境下进行检测和分析的仪器，磷脂膜的这种空气不稳定性限制了这 类仪器的应用。有报道采用甲叉丙烯酰胺_山梨酰卵磷脂(bis-SorbPC)在二氧化硅表面先形成 磷脂双层膜，然后通过紫外线照射使磷脂分子侧链发生光聚合，形成聚合化的磷脂膜层，这 种膜层虽具有空气稳定性，但失去了磷脂膜的流动性。另有报道将蛋白分子包被到磷脂膜 表面，使磷脂膜得以在空气中保持稳定，但需要覆盖有非常致密的蛋白层。也有报道在磷脂 膜中添加修饰有PEG分子的磷脂分子，能使得磷脂膜具有空气稳定性。还有利用PEG-胆固 醇分子作为栓膜材料，可以实现磷脂膜的空气稳定性，但这些方法在制备空气稳定性磷脂 膜时，或是操作要求苛刻，或是存在重复性差等问题，无法实现有效应用。
发明内容
本发明的目的是解决现有在固体基底表面无法修饰空气稳定性磷脂膜技术的不 足，提供一种在固体基底表面修饰空气稳定性磷脂膜的方法。根据本发明的固体表面修饰空气稳定性磷脂膜的方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤1)制备含聚乙二醇化磷脂分子的、大小均一小单壁磷脂囊泡；2)将步骤1)得到的小单壁磷脂囊泡与壳聚糖改性的固体表面室温静置反应；以 及
3)去除未结合的磷脂囊泡。根据本发明的方法，其中，所述小单壁磷脂囊泡溶液通过以下步骤制备a)用氯仿溶解磷脂；b)氮气吹干，真空干燥至氯仿完全挥发；c)加缓冲液水化；d)水浴超声处理至溶液澄清；以及e)挤压过膜，其中，挤压用滤膜的孔径为50nm，挤压次数至少11次。根据本发明的方法，其中，所述聚乙二醇化磷脂分子为聚乙二醇聚合物与磷脂分 子通过化学共价键合而成。根据本发明的方法，其中，所述聚乙二醇化磷脂分子的摩尔百分含量不超过 5mol % ο根据本发明的方法，其中，在步骤2)中，所述囊泡溶液和固体表面室温静置反应 5 10分钟。本发明方法能在固体表面修饰具有空气稳定性的磷脂膜。PEG分子可促进囊泡在 固体基底的吸附和融合作用，先在固体基底形成单个磷脂双层膜，由于膜层表面的PEG分 子对上层磷脂膜具有空气保护作用，固体表面的壳聚糖能够保护下层磷脂膜的稳定结构， 从而达到磷脂膜层在空气中保持稳定的目的。综上所述，根据本发明提供了一种在壳聚糖改性的固体基底上利用掺有一定量 PEG化磷脂的囊泡，修饰形成具有空气稳定性的磷脂膜的方法。该方法可解决常规方法修 饰磷脂膜时的空气不稳定性问题。另外由于PEG化磷脂的添加，使小单壁磷脂囊泡的制备 时间大大缩短，且提高了磷脂囊泡的稳定性。利用该方法形成的磷脂双层膜，具有良好的空 气稳定性，操作方便，重复性好，并且通过调节PEG分子的含量，可以形成均勻致密的单个 磷脂双层膜，为需要修饰空气稳定性磷脂膜的相关应用研究领域提供了一项有效的方法依 据。
图1 本发明空气稳定性磷脂双层膜的形成机理示意图；图2 本发明的壳聚糖改性固体表面形成空气稳定性磷脂膜的椭偏成像图；图3 本发明的通过调节PEG含量形成单个磷脂双层膜的椭偏成像图；图4 本发明在壳聚糖改性固体表面形成空气稳定性磷脂膜的原子力显微镜高度 和相位分析图。
具体实施例方式本发明提出在固体表面形成单个磷脂双层膜的方法，只需制备含一定浓度PEG化 磷脂的尺寸均勻的小单壁磷脂囊泡溶液，然后与壳聚糖改性的固体表面室温静置反应即可 形成。如图1所示，先用氯仿溶解磷脂，然后用氮气吹和真空干燥处理将氯仿挥发殆尽， 在容器壁上形成磷脂薄膜，加入一定量的缓冲液对磷脂薄膜进行水化，水浴超声至清后，用 挤压器挤压过膜得到尺寸均勻的小单壁磷脂囊泡溶液。将小单壁磷脂囊泡溶液与壳聚糖改性的固体表面室温静置反应，最后用去离子水洗去残余的囊泡即可。实施例1 配制1，2_ 二豆蔻酰磷脂酰胆碱(l，2-Dimyristoylphophatidylcholine，DMPC) 的氯仿溶液，其中含1，2- 二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇2000) (1,2~Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethyleneglyco 1)-2000],DSPE-PEG2000)分别为0. 1、0· 5、1. 5mol%0先用氮气将大部分氯仿吹干，然后真 空干燥至少2h，以除去残留的氯仿，同时在容器壁上形成磷脂薄膜；加入一定量的磷酸盐 缓冲液(pH 7.4)将薄膜水化，并使DMPC的终浓度为ImM。水浴超声处理30-60min至溶液 呈澄清状；然后将溶液采用Avanti公司的MiniExtruder进行挤压，选用孔径为50nm的聚 碳酸酯膜，挤压次数不少于11次。用常规方法进行硅片表面的氨基化改性，将清洗干净的硅片用浓硫酸、过氧化 氢(体积比3 1)振荡处理30分钟，用水清洗后，转入含10%的氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)乙醇溶液中振荡处理2小时，冲洗干净后，即得氨基改性表面。用5%的戊二醛溶 液处理氨基改性硅片，室温振荡处理1小时后冲洗干净，再与待固定的低分子量壳聚糖溶 液反应10分钟，水洗，氮气吹干备用。将以上制备好的小单壁磷脂囊泡和二氧化硅表面静置反应，室温5-lOmin后，用 去离子水洗去未结合的多余囊泡即可。 采用成像椭偏检测技术对以上三种不同DSPE-PEG2qq浓度的磷脂膜进行检测，如图 2所示，椭偏仪测量其膜厚分别为7. 3nm、6. 2nm和4. 9nm(从左至右)，图3所示为原子力显 微镜在空气状态下对磷脂膜的分析结果。实施例2配制1，2_ 二油酰磷脂酰胆碱(Dioleoylphatidylcholine，D0PC)的氯仿溶液，其 中含Imol %的DSPE-PEG2_，先用氮气将大部分氯仿吹干，然后真空干燥至少2h，以除去残 留的氯仿，同时在容器壁上形成磷脂薄膜；加入一定量的磷酸盐缓冲液(PH 7.4)将薄膜水 化，并使DOPC的终浓度为ImM。水浴超声处理30-60min至溶液呈澄清状；然后将溶液采用 Avanti公司的MiniExtruder进行挤压，选用孔径为50nm的聚碳酸酯膜，挤压次数不少于 11次。“壳聚糖改性的玻璃表面”的制备步骤同实施例1。将以上制备好的小单壁磷脂囊泡和经壳聚糖改性的玻璃表面静置反应，室温 5-lOmin后，用去离子水洗去未结合的多余囊泡即可。实施例3配制1，2- 二月桂酰磷脂酰乙醇胺(1，2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphoethan olamine,DLPE)的氯仿溶液，其中含2mol %的DSPE-PEG2■，先用氮气将大部分氯仿吹干，然 后真空干燥至少2h，以除去残留的氯仿，同时在容器壁上形成磷脂薄膜；加入一定量的磷 酸盐缓冲液(pH 7.4)将薄膜水化，并使DLPE的终浓度为ImM。水浴超声处理30-60min至 溶液呈澄清状；然后将溶液采用Avanti公司的MiniExtruder进行挤压，选用孔径为50nm 的聚碳酸酯膜，挤压次数不少于11次。“壳聚糖改性的二氧化硅表面”的制备步骤同实施例1。将以上制备好的小单壁磷脂囊泡和壳聚糖改性的二氧化硅表面静置反应，室温5-lOmin后，用去离子水洗去未结合的多余囊泡即可。实施例4配制卵磷脂(egg phosphocholine)的氯仿溶液，其中含3mol %的1，2_ 二豆蔻 酰 _ 甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇 2000) 1,2-Dimyristoylphosphatidyleth anolamine-N- [Methoxy (Polyethylene glycol)-2000]，DMPE-PEG2_)，先用氮气将大部分 氯仿吹干，然后真空干燥至少2h，以除去残留的氯仿，同时在容器壁上形成磷脂薄膜；加入 一定量的磷酸盐缓冲液(PH 7.4)将薄膜水化，并使卵磷脂的终浓度为ImM。水浴超声处理 30-60min至溶液呈澄清状；然后将溶液采用Avanti公司的MiniExtruder进行挤压，选用 孔径为50nm的聚碳酸酯膜，挤压次数不少于11次。“壳聚糖改性的二氧化硅表面”的制备步骤同实施例1。将以上制备好的小单壁磷脂囊泡和壳聚糖改性的二氧化硅表面静置反应，室温 5-lOmin后，用去离子水洗去未结合的多余囊泡即可。实施例5配制DMPC的氯仿溶液，其中分别含3mol%,5mol%的1，2_二豆蔻酰-甘油_3_磷 脂酰乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇 1000) l，2-Dimyristoylphosphatidylethanolamine-N-[M ethoxy (Polyethylene glycol)-1000]，DMPE-PEG1000)，先用氮气将大部分氯仿吹干，然后真 空干燥至少2h，以除去残留的氯仿，同时在容器壁上形成磷脂薄膜；加入一定量的磷酸盐 缓冲液(PH 7.4)将薄膜水化，并使卵磷脂的终浓度为ImM。水浴超声处理30-60min至溶液 呈澄清状；然后将溶液采用Avanti公司的MiniExtruder进行挤压，选用孔径为50nm的聚 碳酸酯膜，挤压次数不少于11次。“壳聚糖改性的二氧化硅表面”的制备步骤同实施例1。将以上制备好的小单壁磷脂囊泡和壳聚糖改性的二氧化硅表面静置反应，室温 5-lOmin后，用去离子水洗去未结合的多余囊泡即可。
权利要求
一种固体表面修饰空气稳定性磷脂膜的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)制备含聚乙二醇化磷脂分子的、大小均一小单壁磷脂囊泡；2)将步骤1)得到的小单壁磷脂囊泡与壳聚糖改性的固体表面室温静置反应；以及3)去除未结合的磷脂囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述聚乙二醇化磷脂的摩尔 百分含量不超过5mol%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小单壁磷脂囊泡通过以下步骤制备a)用氯仿溶解磷脂；b)氮气吹干，真空干燥至氯仿完全挥发；c)加缓冲液水化；d)水浴超声处理至溶液澄清；以及e)挤压过膜。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤e)中，挤压用滤膜的孔径为50nm，挤 压次数至少11次。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂分子为聚乙二醇聚合 物与磷脂分子通过化学共价键合而成。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述囊泡和固体表面室温静置 反应5 10分钟。
全文摘要
本发明涉及表面化学及应用化学领域，具体地，本发明涉及一种固体表面修饰空气稳定性磷脂膜的方法。根据本发明的方法包括1)制备聚乙二醇(PEG)化磷脂分子的小单壁磷脂囊泡溶液，其中PEG化磷脂分子的摩尔百分含量不超过5mol％；2)将步骤1)得到的小单壁磷脂囊泡溶液与壳聚糖改性的固体表面室温静置反应；以及3)去除未结合的磷脂囊泡。该方法可解决常规方法修饰磷脂膜时的空气不稳定性问题，另外由于PEG化磷脂的添加，使小单壁磷脂囊泡的制备时间大大缩短，且提高了磷脂囊泡的稳定性。利用该方法形成的磷脂双层膜，具有良好的空气稳定性，操作方便，重复性好。如果添加2mol％-3mol％浓度的PEG化磷脂分子，还可实现具有空气稳定性的单个磷脂双层膜的修饰。
文档编号C03C17/28GK101955377SQ200910088949
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者张义浜, 陈艳艳, 靳刚 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所