含有作为活性剂的致免疫的酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露低聚糖的疫苗的制作方法

专利名称：含有作为活性剂的致免疫的酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露低聚糖的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及Th2-介导的疾病或紊乱的治疗。更具体地说，涉及患有该疾病或紊乱的患者的治疗和未患病者抵抗该疾病或紊乱的预防性治疗。
哮喘是气道的慢性炎性病症，有许多细胞包括肥大细胞和嗜酸性细胞对该病症起作用。在易感的个体中，该炎症引起通常与流传广但可变异的气流梗阻相关的症状，所述的梗阻常常自发或通过治疗可逆的，和引起气道对多样刺激的反应相关性增加。
哮喘可以被遗传，不是接触传染的，可以是慢性的和持续的或周期性的和通常至少部分地可逆的发作型发病。发作的严重程度和频率随不同的患者而变化。许多因素可能有助于哮喘的发展，包括接触吸入性变应原例如花粉，霉菌孢子，住宅粉尘螨和动物皮屑。对于已产生哮喘的个体，许多剌激物可以触发哮喘发作包括变应原，病毒的呼吸感染(感冒或流感)，空气中的刺激物(烟尘，空气污染，香水)，潮湿，寒冷气候，和运动。
在哮喘发作期间，支气管周围的肌肉绷紧和支气管的内层膨胀(变为红肿的)，产生浓稠的粘液，因此降低了管的内径。这些变化增加对空气流动的阻碍，使得呼吸困难。当哮喘被适当地控制时，支气管处于正常的大小。
哮喘是儿童和成人共有的疾病。在美国估计有7％的人已经被诊断为气喘。在新西兰对应的数据是约10％(Burney，P.等人(1996)，呼吸症状流行的变异，哮喘发作的自报，欧洲共同体的呼吸健康调查哮喘药物治疗的使用，Eur.Respir.J.9687-695)。在近30年来，西方和发展中国家哮喘的发生显著地增加。(这种情况出现在)如此相当短的时间内，暗示着环境比遗传因素造成的影响更大。
在大多数的病例中，哮喘是特异反应性的病症，其中优先的病变是由于对共同的环境的变应原的过敏的应答。这种过敏的应答是免疫系统的功能，其特点是嗜酸性细胞活化和聚集到肺脏，引起气道的特异的慢性肿胀和炎症，影响患者的呼吸。
哮喘的治疗药品包括几个不同的种类的药物，包括β激动剂，局部用的或口服的类固醇和茶叶碱。如果使用恰当，这样的治疗可避免哮喘系统的发展或当哮喘系统已存在时减轻(程度)。β促效药和茶叶碱主要地通过使气道周围的肌肉松弛起作用，而类固醇的作用在于减少(和甚至阻止)炎症和粘液产生。也存在其它的治疗药物，并且由于世界范围哮喘的流行，发病率和死亡率的增长和对此的关顾正开发研究更多的药物。
哮喘症的免疫学基础是气道产生了炎症，包括淋巴细胞Th2(Th2s)。这些细胞分泌细胞因子，包括白介素-4(IL-4)和IL-5，分别导致由B细胞产生的免疫球蛋白E(IgE)加强和嗜曙红细胞的产生和聚集。变应原对肥大细胞的激活释放引起急性炎性的应答，包括粘液产生的组胺和其它的中间体化学药品。嗜酸性细胞释放导致支气管上皮发炎和坏死的传递介质体，包括细胞毒素。将嗜酸性细胞的局部聚集和活化，以及由此产生的组织损害称为“嗜曙红细胞增多”。
因此除了一旦已经发病而使用抑制气道发炎的药物进行治疗，或降低患气喘症个体症状的药物进行治疗的传统方式，尚需要控制免疫系统以降低特异反应性的发展和气道发炎的危险的治疗方法。如果这样的治疗对现在的特应性病症患者也具有相似的抑制作用，可以降低疾病的严重程度，将是额外受益的。
满足该需要的免疫学途径包括牛分支杆菌卡介菌(BCG)。Erb等人(J.Exp.Med.，Vol.187，No.4，February 16 1998)已经报道在小鼠中该微生物在先的活性感染，抑制了随后的变应原诱导的气道嗜曙红细胞增多，并且报道鼻内的感染比腹膜内的或皮下的感染更有效。
还有人已经报道在中国生物体形式的卡介苗和BCG-多糖核酸形式的卡介苗可用于哮喘的治疗(参见，例如China J.Paedia(1991)；39(3)165-167，广州医学杂志1984；15(2)16-18)和湖南医科大学学报1992；17365-367。据报道活的和死的完整的BCG都可给药。已报道的给药的途径可在肌内注射和擦伤接种疫苗之间变化。
以前免疫学组合物已经包括脂聚糖(包括LAM)。例如，美国专利说明书5,853,737(Modlin)讨论诱导一种受CD1限制的免疫应答的各种方法，和教导了含有呈现CD1-的非多肽疏水的抗原和尤其是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原的疫苗。
美国专利说明书4,329,452和4,394,502(Maruyama)教导了脂多糖在肿瘤的免疫治疗剂中作为活性的成分的应用。该脂多糖起源于人的结核杆菌。
也已经报道了LAM有效抑制气道的嗜曙红细胞增多。暗示它是BCG的成分，负责BCG对小鼠的变应原诱导的气道嗜曙红细胞增多的抑制作用，如Erb等人(参见上文)报道。
现在申请人意外地发现分支杆菌细胞壁有一额外的活性成分能够抑制Th2介导应答，和随后发生的身体的影响如气道嗜曙红细胞增多。因此本发明涉及供交替使用的免疫学途径，包括更多的活性剂，致免疫的形式的酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露低聚糖(PIM)。
已经有人报道从肺结核分支杆菌提取的PIM参与天然的杀伤T(NKT)细胞的聚集(Apostolou等人，PNAS，1999，96，5141-6)。在Apostolou等人2000和WO 0063348中教导了PIM-激活的NKT细胞在诱导肉芽肿的应答中的应用。
还有人报道由疏水的和亲水的成分组成的合成的非肽抗原(Porcelli和Moody，1999，WO 99 12562，US6,236,676)。有人描述了在用合成的，和分支杆菌起源的抗原治疗之后，T细胞系LDN5受CD1限制的体外增殖。
然而，就申请人所知，在疫苗中还没有使用或计划使用PIM作为免疫活性剂，以预防或治疗Th2-介导的疾病或紊乱。
因此本发明的目的是提供预防性地或治疗性的治疗这样的疾病和紊乱的免疫学途径，从而至少提供了除现存的方法以外的有用的选择方案。
本发明所述的“致免疫的PIM”是指除了完整的分支杆菌生物体的一部分以外的PIM，PIM能够诱导患者的免疫应答。
本发明所述的“抵抗Th2-介导的疾病或紊乱的预防性的治疗”是指使非患者免于这样的疾病或紊乱的治疗，以防止或至少降低所关爱的个体遭受所述疾病或紊乱的可能性。
本发明所述的“抵抗Th2-介导的疾病或紊乱的治疗学治疗”包括阻止或降低与Th2-介导的疾病或紊乱，包括支气管发炎和嗜曙红细胞增多相关或与其征兆相关的严重程度。
便利的是，Th2-介导的疾病或紊乱选自于变应性和特应性紊乱。
实例包括变应性的鼻炎，皮肤炎和牛皮癣。优选的是，上述的Th2介导的疾病或紊乱是哮喘。
在一个实施方案中，本发明提供了用于诱导患者免疫应答的疫苗，所述患者遭受或易感涉及支气管炎症和/或气道嗜曙红细胞增多的症状，该疫苗包括作为活性剂的致免疫的PIM。
优选的是，将所述的疫苗配制为可以给所述的患者呼吸系统用药的形式。然而，还涉及其它途径给药的制剂，但是这些不限于皮下的，真皮内的，肌内的，尿道内的，直肠内的，阴道内的和眼内的给药。
本发明中的“呼吸给药”是指给患者的气道给药，包括鼻内给药和通过口腔吸入到达呼吸道。
本发明进一步提供了用于降低Th2-介导的疾病或紊乱的严重程度的疫苗，包括免疫学有效量的致免疫的PIM。再者，优选的是将所述疫苗配制为呼吸给药的剂型。
进一步地，本发明提供了用于降低发展为Th2-介导的疾病或紊乱危险的疫苗，包括免疫学有效量的致免疫的PIM。再者，优选的是将所述疫苗配制为呼吸给药的剂型。
方便的是，所述的致免疫的PIM是从分支杆菌属分离的，更方便的是，是从牛分支杆菌生物体分离，最方便的是，从牛分支杆菌菌株AN5分离。
对于所述的的致免疫的PIM平常是液体，优选的是溶液或悬浮液形式。
方便的是，对于进行呼吸给药的疫苗，优选的是进一步地包括呼吸可接受的佐剂，可以包括清洁剂或表面活性剂成分。
也可以包括选自于一个或多个诱导Th1型免疫应答的物质的第二免疫原。优选的是，包括诱导所述的Th1型免疫应答的物质的牛分支杆菌(卡介菌)，虽然LAM也可用作为第二免疫原。
在另一方面，本发明提供了预防性地治疗患者使之抵抗Th2-介导疾病或紊乱的方法，包括通过以有效量的致免疫的PIM给药在所述的患者中诱导免疫应答。
所述的PIM优选的是呼吸给药。
再一方面，本发明提供了治疗性地治疗患者的Th2-介导的疾病或紊乱的方法，包括通过以有效量的致免疫的PIM给药在所述的患者中诱导免疫应答。
再一次说明，所述PIM优选的是呼吸给药。
方便地，所述的致免疫的PIM以上面描述的疫苗形式给药。
通常，致免疫的PIM是通过口腔或鼻内吸入到所述的患者给药。
在另一方面，本发明提供了致免疫的PIM在制备用于治疗Th2-介导的疾病或紊乱中的应用。
另一方面，本发明提供了致免疫的PIM在制备用于预防性治疗Th2-介导的疾病或紊乱中应用。
在优选的实施方案中，致免疫的PIM是从分直杆菌属，更优选的是从牛分支杆菌生物体，和最优选的是牛分支杆菌菌株AN5分离的。
所述药物的制备是常规方法，将所述的致免疫的PIM与呼吸可接受的佐剂结合，以便将该药物配制为呼吸给药。
最后一个方面，本发明提供了用于预防性或治疗性治疗Th2-介导疾病或紊乱的装置，包括一个容器，在该容器中将上面所述的疫苗分配到需要这样的治疗的患者的气道。
方便的是，该装置可以是这样的一个容器，在该容器中将如上所述的疫苗分配为可用于通过患者的口腔吸入，或鼻内可配药的形式。
附图2图示了由BAL回收的嗜曙红细胞的百分数。小鼠(每组4-5只)用PIM治疗。
附图3图示了由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。小鼠(每组4-5只)用PIM治疗。
附图4图示了由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。小鼠(每组4-5只)用去酰基化的PIM治疗。
附图5图示了由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。小鼠(每组4-5只)用从耻垢分支杆菌分离的PIM治疗。
附图6图示了由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。在第二次腹膜注射之后一星期和OVA攻击之前六星期小鼠(每组4-5只)用PIM治疗。
附图7图示了由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。在OVA攻击之前八和两星期小鼠(每组4-5只)用PIM治疗。OVA腹膜易感后在四和两星期的情况。
附图8显示由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。在OVA攻击的同时小鼠(每组4-5只)用PIM治疗。
附图9图示了在CD1敲出的小鼠中由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。小鼠(每组4-5只)用PIM治疗。
附

图10图示了在IFNy敲出的小鼠中由BAL回收每毫升嗜曙红细胞的数目。小鼠(每组4-5只)用PIM治疗。
本发明应用的其它免疫和/或特应性的紊乱包括变应性的鼻炎，皮肤炎和牛皮癣，但这些只是实例。
本发明的方法的必要特征是将致免疫形式的生物学活性量的酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露寡糖(PIM)给药。通过PIM导入到患者的气道可优选地实现，但是不以任何方式限制。同样地可以使用供选择的给药途径，其它实例是通过粘膜(transmucosal)，经尿的(intraural)，皮下的，真皮内的，肌内的，经口的，尿道内的，直肠内的，阴道内的和眼内给药。
本发明使用术语“PIM”是指酰基甘油基磷脂酰基肌醇甘露寡糖，可以是含有至多40个甘露糖单元的LM，但不是LAM。
脂肪酸成分包括一个或多个脂肪酸单元，优选的是2到6个单元，更优选的是2个单元。优选的是脂肪酸单元长度为10到22个碳原子，更优选的是长度为16到20个碳原子。例如脂肪酸成分可以是肉豆蔻酸酯，棕榈酸酯，十七烷酸酯，硬脂酸酯，结核硬脂酸酯或亚麻酸酯，或其混合物。
用于本发明的PIM可以具有下列的通式 其中x是1到40，优选的是1到6，R和R1各自代表脂肪酸链。
本发明使用的PIM可以是合成的或从天然的来源获得。通过磷脂酰肌醇团与二酰基甘油反应，以化学方法合成PIM，随后进行甘露糖化或本领域内已知的其它方法。
PIM也存在于放线菌，是革兰氏阳性细菌的有特色的系。该系的成员包括马红球菌，白喉棒杆菌，马氏棒杆菌，深红戈登氏菌，土生戈登氏菌，椿象红球菌和微代谢冢村氏菌。
该世系的其它成员包括分支杆菌，PIM是分支杆菌细胞壁的成分。
用于本发明时，PIM形式也可以通过从合适的放线菌生物体分离获得。然而优选的是，用于本发明的致免疫的PIM可以从分支杆菌，特别是致病的分支杆菌，或从减毒的致病的分支杆菌菌株获得。然而，绝非排除来自于非致病的无毒力的分支杆菌PIM。
特别适用于获得PIM的分支杆菌是牛分支杆菌，结核分支杆菌和副结核分支杆菌，目前优选的是牛分支杆菌生物体，例如牛分支杆菌菌株AN5。
利用本领域内标准的技术可以从这样的细菌特别是从分支杆菌分离PIM。作为示例，可以使用Severn等人，J.Microb.Methods，28，123-30(1997)的方法。
方便的是将分离的PIM纯化后用于本发明。纯化的作用是从PIM排除其它的细菌成分(包括细菌核酸)。再者，可以使用本领域内的标准技术如Severn等人描述的。
一旦获得PIM，优选的是纯化获得PIM后，将其配制为制剂用于给药。详细的配制方式将取决于所选定的给药途径，并且是本领域内熟练的技术人员的常规选择。
优选的是，将PIM配制为用于呼吸给药的形式。呼吸给药要求将PIM递送到待治疗患者的气道。通常，这将涉及经过口腔或鼻内递送。通常由患者吸入给PIM提供动力。然而呼吸给药也可以通过推进剂递送，包括利用喷嘴或超声的喷雾器产生的气溶胶形式。目前它们是优选的。
对于该应用，PIM方便以流体形式。这可以是粉末或溶液或悬浮液(特别是气溶胶形式应用)。
通常也将PIM配制为与呼吸可接受的佐剂一起呼吸给药。佐剂的选择将依赖于制剂本身，所涉及的配药方式，但是在任何情况下，对于本领域技术人员而言将是常规的选择。
优选的是，借助于喷雾器产生的气溶胶而将PIM给药，PIM可以是含有这样的佐剂成分的溶液或悬浮液形式。这样的可选择的但是首选的成分是无毒的清洁剂或表面活性剂。实例包括聚山梨醇酯80，beractant(Survanta Susp(Abbott))和colfosceril棕榈酸酯(Exosurf Neonatal(GlaxoWellcome))。
在以气溶胶形式给药时可以在溶液或悬浮液中包括其它的免疫原。通常这样的免疫原是诱导Th1型免疫应答的物质。这样的物质可以是活的或死的BCG，但是优选的是死的。另一种这样的物质是LAM。
当包括BCG作为第二免疫原，通常将是以进一步包括非凝集药剂(例如牛血清白蛋白)的溶液或悬浮液形式使用，以阻止生物体依附在一起。
尽管优选的是气溶胶形式给药，但绝非要排除以其它的形式的PIM给药。相反，PIM疫苗可以配制为粉末形式给药，例如在干燥的粉末吸入器中利用乳糖胶囊做为递送赋形剂。
可以理解，PIM可以与其它治疗上可接受的药剂联合用于治疗或配制为药物。
现在通过参照下列的实验部分举例说明本发明，必须理解这些例子是作例证的，而不起限制作用。试验A部分从牛分支杆菌AN5分离酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露寡糖(PIM)分离和纯化一般方法Triton X-114，蛋白酶K，RNase和DNase来源于Boehringer Mannheim。商品试剂和溶剂是分析纯的。所有的试验用MilliQ水完成的。洗脱材料的凝胶过滤性质基于配药系数Kav＝(Ve-Vo)/(Vt-Vo)表示，其中Vo是该系统的空白体积，Ve是特定材料的洗脱体积，Vt是该系统的总体积。
细菌细胞培养牛分支杆菌AN5是从英国维布里奇(Weybridge)中心兽医实验室得到。并且在改良的Reids合成培养基((S.Landi，in G.P.Kubica，和L.G.Wayne(Eds.))上生长八个星期成为表膜形式。分支杆菌-A Sourcebook结核菌素的生产和标准化，Marcel Dekker Inc.，纽约(1984)，pp 505-535)。通过加热到100℃，3小时杀死细胞，然后收集到粗糙的Whatman过滤纸上。
分离和纯化步骤与甲醇/氯仿(1∶1)一起搅拌去脂化(delipidated)收集的细胞，通过离心收集之后，干燥(所得的)小丸。然后用2.5％Tris缓冲盐水(TBS)(0.05M，pH7.5)洗涤细胞2次，离心回收(10,000g，30分钟)并且冷冻干燥。将约2g(干重)的细胞在含有EDTA(5mM)和叠氮化钠(0.05％)的TBS(4毫升)中搅成浆糊，冷却到4℃，以40,000kPa通过French压榨机2次进行挤出。用TBS将分裂的细胞溶液制备为毫升体积，在加入氯化镁(10mM)之后，用RNase和DNase(1微克/毫升)在37℃消化破裂细胞60分钟，然后在60℃消化额外的60分钟。
将Triton X-114加入到裂解的细胞中，到浓度为8％(v/v)，在冰上冷却之后，在4℃将溶液搅拌16小时。通过离心(10,000g，4℃，30分钟)去除细胞的碎片，在37℃培养上层清液以诱导位相分离。在离心(4000g，300C，20分钟)之后回收下层的Triton X-114浓厚相，上面的含水层与细胞碎片混合，如上所述再提取。合并清洁剂相，通过加入冷乙醇(-20℃，95％，5vol.)使脂聚糖沉淀，通过离心收集(10,000g，30分钟)。
将粗制的脂聚糖提取物溶解于水(10-20毫克/毫升)，搅拌过夜，以35,000g超离心16小时。收集沉淀，溶解于最小量的水，并且用蛋白酶K(1毫克/毫升)在37℃处理一小时，然后在60℃再处理一小时。将该溶液超离心2次以上，在水中重新构成和冷冻干燥。
分馏步骤 通过重新悬浮于Tris-脱氧胆酸缓冲液(Tris-HCl 10mM，pH8.0，EDTA 10mM，NaCl 0.2M，脱氧胆酸0.25％，NaN30.02％)到10毫克/毫升，制备粗制的样品用于柱层析。样品上样到SephacrylS-200(Pharmacia)柱(1.5×100cm)，使用相同的缓冲液洗脱。连续地监测洗脱液的折射指数变化，收集馏分(2毫升)，用比色机分析中性的葡萄糖(Dubois，M.，Gilles，K.A.，Hamilton，J.K.，Rebers，P.A.和Smith，F.(1956)，用色度法测定糖和相关的物质。Anal.Chem.28，350-356)和进行SDS-PAGE。分析SDS-PAGE的馏分识别高分子量种类(Kav＝0.1)如LAM和对应于LM和PIM的组具有Kav’s分别为0.3和0.8。收集合适的LAM，LM和PIM馏分合并，通过在centriplus浓缩器(Amicon)，利用3000MW截止膜超滤除去盐分，重新悬浮于水，冻干。
收集含有LAM，LM和PIM的馏分，并且冻干。将估计为大约25％的粗制的材料的纯LAM上样到柱，总产量为1.4％的起始的细菌干重。在分馏法之后回收的纯LM和PIM分别是1.0％和3.7％。PIM的脱酰作用将PIM悬浮于无水肼(30分钟)，用冷丙酮(-70℃)冷却和结束以破坏过量肼和使去酰基化PIM沉淀。
通过离心将去酰基化PIM沉淀，用丙酮洗涤小丸，溶解于水和冻干。
NB.分析用于进行整个PIM分子的碳水化合物分析。脂多糖分析研究了合并PIM馏分的纯度。基于下列标准由BCA蛋白质测定指示0％蛋白质，由纯化的提取液的元素分析指示没有氮，在葡萄糖分析中没有核糖或脱氧核糖，确认PIM是纯的。
采用已知方法将纯化的PIM水解和乙酰化，GLC分析得到的糖类混合物。
来自于牛分支杆菌AN5的酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露-寡糖的碳水化合物和脂肪酸馏分


B部分免疫学试验模型将卵清蛋白(OVA)诱导的异位的气道炎症的气道嗜曙红细胞增多小鼠模型用于测定抑制气道嗜曙红细胞增多发育的致免疫PIM的效力。该模型被广泛地用于建立小鼠“相似于哮喘的效果”，参见例如，Erb等人，J.Exp.Med.187(4)561-569(1998)；Herz等人J.Allergy and ClinicalImmunology，102867-874(1998)；和Randaolf等人J.ClinicalInvestigation，1041021-1029(1999)。小鼠将小鼠C57B1/6J小鼠喂养，圈养在惠灵顿医学动物设备学校(Wellington，新西兰)。由动物伦理学委员会批准实验规程，并且根据Otago大学(Dunedin，New Zealand)准则照料动物。OVA-诱导的气道炎症易感将溶于200毫升明矾佐剂(Al(OH)3，Serva，Heidelberg，德国)的2微克卵清蛋白(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)在0天腹膜内注射(腹膜)易感的6-8星期大的小鼠(每组4-5个小鼠)。在第14天以溶于200微升明矾佐剂的2微克卵清蛋白进行激发剂腹膜内注射给药。
OVA作用在第二次腹膜注射之后，OVA处理14天，通过用氯胺酮和赛拉嗪(Sigma Chemical Co.)混合物麻醉小鼠。然后用溶于PBS的50微升的2mg/l的卵清蛋白鼻内接种小鼠。用PIM的免疫接种方案(a)在第二腹膜注射之后7天，用PIM(a)免疫接种方案，如上所述，麻醉小鼠。然后用指示浓度的溶于50微升PBS的PIM鼻内免除接种小鼠。对照小鼠鼻内给药PBS。在用PIM免除接种之后用OVA7鼻内处理小鼠。
(b)如在(a)所述，给小鼠免疫接种，在用PIM治疗之后6星期，以OVA鼻内处理给药。
(c)在用OVA鼻内处理之前8星期，6星期，5星期，4星期和2星期用PIM鼻内免疫接种小鼠。
如上所述，易感小鼠出现在4和2星期。
(d)在OVA鼻内处理的同时用PIM鼻内免疫接种小鼠。气道嗜曙红细胞增多的测量在用OVA鼻内气道攻击之后4天，牺牲小鼠。在气管中插套管和进行支气管肺泡灌洗(BALS)(3×1mlPBS)。计数总的BAL细胞数目，利用cytospin旋转到玻璃载物片，利用标准组织学标准用显微镜测定嗜曙红细胞，巨噬细胞，淋巴细胞和嗜中性白细胞的百分数。结果附图1-10显示所描述的试验结果。
附图1显示从用PIM治疗的小鼠的BAL分泌液回收的细胞的总的数目。附图2显示BAL分泌液中嗜曙红细胞的百分数的剂量依赖性的减少。附图3显示用PIM治疗的小鼠每升嗜曙红细胞数目的剂量依赖性的减少。附图4显示去酰化的PIM对BAL分泌液的嗜曙红细胞数目的影响。附图5显示从用来自于非致病的耻垢分支杆菌的BAL分泌液中嗜曙红细胞数目的剂量依赖性的减少。附图6显示PIM对OVA易感之后的BAL分泌液的嗜曙红细胞的长期抑制作用。附图7显示用OVA易感之前和期间用PIM治疗的小鼠的BAL分泌液中嗜曙红细胞数目的减少。附图8显示在用OVA攻击的同时用PIM治疗的小鼠的BAL分泌液中嗜曙红细胞数目的减少。附图9显示PIM对CD1敲出小鼠的BAL分泌液中嗜曙红细胞数目的影响。附图10显示PIM对IFNy敲出小鼠的BAL分泌液中嗜曙红细胞数目的影响。结论从致病的和非致病的细菌获得的PIM可有效地抑制气道嗜曙红细胞增多。在对抗原易感之前，期间和之后，以及抗原攻击期间可以抑制嗜曙红细胞增多。
这些数据表明PIM显然可作为疫苗的活性剂用于治疗Th2-介导的疾病或紊乱，如哮喘是一个特定的例子。从该数据看出PIM可以用于预防性的和治疗性的应用。通过除去脂肪酸尾部缺乏CD 1或IFNy，取消嗜曙红细胞增多的抑制。因此可预期所有的三个在PIM分子的作用机理中是重要的。产业应用从上面描述将认识到，本发明的最主要的应用是用于治疗Th2-介导的的疾病或紊乱。治疗可以是预防性的，防止或降低发展这样的疾病或紊乱的危险或者可以是治疗性的，抑制已确认的疾病或症状。
将含有PIM-的本发明的疫苗配制为便于给药，优选的是，包括通过鼻内的或方便的吸入途径的呼吸给药。吸入给药方式包括使用配药装置，在该容器形成部分PIM疫苗。该装置可以是喷雾器，特别是喷射喷雾器例如已知的有Omron CX(Omron Healthcare，Singapore)，医师辅助的Ventstream或工人nebuliser(Aerosol Medicals，Colchester，UK)(该疫苗以气溶胶形式给药)或一个干燥的粉末吸入装置(例如已知为Accuhaler和Diskhaler(Glaxo Wellcome)的装置)。
已经显示呼吸给药可用于降低嗜曙红细胞数目，依次降低支气管炎症。对本领域内技术人员显而易见可以暗示两个方面抗拒攻击，降低Th2介导的状态(例如哮喘发作)的严重程度，和用于治疗个体使之抵抗发展中的Th2-介导的状态，例如哮喘。
已经描述了使本发明起作用的优选的方法，应当理解可以对本发明实行改进，但其仍然在本发明总的构思范围之内。可以理解所有的这样改进是在本发明的范围内。
权利要求
1.诱导患者有效抵抗Th2-介导的疾病或紊乱的预防性的治疗或治疗性的治疗的免疫应答的疫苗，包括作为活性剂的以致免疫形式的致免疫的酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露寡糖(PIM)。
2.诱导患者免疫应答的疫苗，所述患者患有或易感包括支气管炎症和/或气道嗜曙红细胞增多的症状，所述疫苗包括作为活性剂的致免疫的PIM。
3.降低正发展为Th2-介导的疾病或紊乱风险的疫苗，包括免疫学有效量的致免疫PIM。
4.根据权利要求1-3任一项的疫苗，其中所述的疫苗配制为呼吸给药。
5.根据权利要求1-4任一项的疫苗，其中所述的致免疫PIM是从分支杆菌属分离的。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述的致免疫PIM是从牛分支杆菌生物体分离的。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其中所述的牛分支杆菌生物体是牛分支杆菌菌株An5。
8.根据权利要求1-7任一项的疫苗，其中所述的PIM含有1-6个甘露糖单元的甘露糖成分形式。
9.根据权利要求1-8任一项的疫苗，其中所述的PIM含有2-6个脂肪酸单元。
10.根据权利要求9的疫苗，其中所述的PIM含有2个脂肪酸单元。
11.根据权利要求9或10的疫苗，其中所述的脂肪酸长度是10-22个碳原子单位。
12.根据权利要求22的疫苗，其中所述的脂肪酸长度是16-20个碳原子单位。
13.根据前面任一项权利要求的疫苗，其中所述的致免疫PIM是液体。
14.根据前面任一项权利要求的疫苗，其进一步包括呼吸可接受佐剂。
15.根据前面任一项权利要求的疫苗，其进一步包括选自于一个或多个Th1-型免疫应答诱导物质的第二免疫原。
16.根据权利要求15所述的疫苗，其中包括作为Th1型免疫应答诱导物质的牛分支杆菌(卡介菌)。
17.治疗性治疗患者Th2-介导的疾病或紊乱的方法，包括通过以有效量的致免疫PIM对患者给药，诱导其免疫应答的步骤。
18.治疗性治疗患者哮喘的方法，包括通过以有效量的致免疫PIM对患者给药，诱导其免疫应答的步骤。
19.根据权利要求17或18的方法，其中所述的致免疫PIM是通过呼吸给药的。
20.根据权利要求17-19任一项的方法，其中所述的致免疫PIM以权利要求1-12任一项要求保护的疫苗的形式给药。
21.根据权利要求17-20任一项的方法，其中所述的致免疫PIM是通过所述患者的口腔吸入给药。
22.根据权利要求17-20任一项所述的方法，其中所述的致免疫PIM是通过所述患者的鼻内给药。
23.致免疫PIM在制备用于治疗性治疗Th2-介导的疾病或紊乱的药物中的应用。
24.致免疫PIM在制备用于预防性治疗Th2-介导的紊乱发展的药物中的应用。
25.根据权利要求23或24的应用，其中所述的Th2-介导的紊乱是哮喘。
26.根据权利要求23-25任一项的应用，其中所述的致免疫PIM是从分支杆菌属分离的。
27.根据权利要求26所述的应用，其中所述的分支杆菌是牛分支杆菌生物体。
28.根据权利要求27所述的应用，其中所述的牛分支杆菌是牛分支杆菌菌株An5。
29.根据权利要求23-28任一项的应用，其中所述的致免疫PIM含有1-6个甘露糖单位的甘露糖成分。
30.根据权利要求23-29任一项的应用，其中所述的致免疫PIM与呼吸可接受的佐剂结合以便将该药物配制为呼吸给药。
31.预防性或治疗性治疗Th2-介导的疾病或紊乱的装置，包括一个容器，在该容器中将权利要求1-12任一项的疫苗分配到需要这样治疗的患者的气道中。
32.根据权利要求31的装置，在该装置中通过患者的口腔吸入将所述的疫苗配药。
33.根据权利要求31所述的装置，在该装置中所述的疫苗鼻内配药。
全文摘要
本发明涉及Th2－介导的疾病或紊乱的预防性治疗或治疗性治疗。提供了用于这些治疗方法的疫苗。所述的疫苗包括作为活性剂的致免疫的酰基甘油基磷脂酰肌醇甘露低聚糖。
文档编号A61P11/00GK1440295SQ01812245
公开日2003年9月3日 申请日期2001年7月2日 优先权日2000年7月3日
发明者韦恩·布鲁斯·塞弗恩, 格雷厄姆·斯蒂芬·勒格罗斯, 雅基耶·露西尔·哈佩尔, 保罗·亨利·阿特金森 申请人:马拉汉医学研究院, 奥塔戈大学, 阿戈里索契有限公司