一种快速高通量可直接测量细胞表面自由能的方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速高通量可直接测量细胞表面自由能的方法，步骤为：首先准备一系列表面张力已知的不同液体，接着分别取上述液体注入离心管内，再把细胞悬浮液注入上述表面张力不同的液体中，并采用试管搅拌器充分混合液体和细胞悬浮液；之后，静置离心管10分钟，再采用离心机将上述1.5mL离心管内的细胞悬浮液在1000rpm下离心1分钟，加速细胞在液体中的聚集和沉降；之后，取出离心管，在离心管架上静置2分钟，采用移液器分别在各1.5mL离心管中取出200μL上清液体，依次注入96孔板的每个孔内；然后采用微孔板分光光度计，测量孔板内上清液体的光密度，其光密度最大时所对应的液体表面张力即可视作细胞的表面自由能。
【专利说明】一种快速高通量可直接测量细胞表面自由能的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞表面自由能的测量方法，特别是一种快速、高通量、且可直接测量细胞表面自由能的方法。
【背景技术】
[0002]细胞表面自由能测量是生命科学、生物技术、能源化工等众多行业中所关注的基础科学问题之一。目前，细胞表面自由能测量方法主要可以分成两大类，即定性法和定量法。
[0003]定性法包括液液接触角法，两相分离法，疏水相互作用色谱法和盐析聚集法，然而，由于定性法不能给出细胞表面能的具体数值，只能给出几种细胞表面能的相对大小，因此，其应用范围受限。
[0004]定量法即直接接触角测量法，该方法是目前唯一可以直接给出细胞表面自由能数值的方法，也是目前最常用的方法。文献I (Appl.Environ.Microbiol.1984，48(5):980-983)中给出，采用直接接触角方法测量细胞表面自由能时，首先需将细胞过滤到膜上，再将细胞过滤膜风干I小时以上，以排除细胞中的水分对接触角测试的影响；然后，通过测量液滴在细胞膜上的接触角，结合复杂的接触角表征技术，来给出细胞表面自由能的具体数值。不过，该方法却存在一些问题:如将细胞过滤到膜上后，细胞在膜上的不均一、不平整的分布将会引入较大的测量误差；而且测量过程中细胞过滤膜风干会对细胞的表面产生较大的破坏；另外，该方法还需要借助复杂的接触角表征技术，才能获得细胞的表面自由能，而且不同的接触角表征技术，也往往会使反推到的细胞表面自由能相差较大。
【发明内容】
[0005]本发明结合直接接触角法测量细胞表面自由能技术中存在的问题，其技术核心是将细胞放入到一系列已知表面张力的溶液中，通过采用离心机来加速细胞的聚集和沉降，之后采用微孔板分光光度计来测量离心后上清细胞悬浮液的浓度，进而获得细胞表面自由倉泛。
[0006]本发明的技术方案为，一种快速高通量可直接测量细胞表面能的方法，具体包括以下步骤:
(1)配置一系列已知表面张力的溶液，且溶液的表面张力范围要涵盖细胞可能的表面能，同时将所配置的溶液按表面张力从小到大依次排列，分别编号；
(2)取5mL细胞悬浮液放入15 mL离心管内，采用0.1 M，PH=7的磷酸缓冲液离心-清洗3次，再将清洗后的细胞再悬浮于新鲜培养液中。同时将细胞悬浮液浓缩到I mL，并放于
1.5mL离心管内。最后，将再悬浮处理后的细胞悬浮液采用试管搅拌器涡旋搅拌20秒，接着超声震动2 min,以使细胞在液体中均匀分布，并完全分散。
[0007](3)准备若干个1.5 mL的离心管，将所配置的已知表面张力的若干个溶液分别采用移液器移取I mL放于标好号的离心管中； (4)将5μ L清洗浓缩后的细胞悬浮液采用移液器注入放有不同表面张力溶液的1.5mL离心管内，采用试管搅拌器涡旋搅拌30 s后，将离心管依次放在离心管架上；
(5)采用离心机将离心管内的细胞悬浮液离心分离，取离心后离心管内上清液体，采用移液器依次移取200 μ L，依次注入96孔板；
(6)采用微孔板分光光度计测量96孔板内上清细胞悬浮液的光密度，光密度最高时所对应的液体的表面张力即为细胞的表面自由能。
[0008]
本发明所具有的优点和积极效果为:
(1)测试时间短、每次可测量的样品数量多；
(2)可通过测量液体的表面张力来直接获得细胞的表面自由能，而不需要借助复杂的接触角表征技术；
(3)所需要的测量样品较少，尤其适用于少量难以取样的生物细胞的测量；
(4)测量精度高、测试结果准确；
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1给出了本发明方法的测量系统。
[0010]图2给出了采用本发明方法测量到的海水小球藻细胞的表面自由能。
[0011]图3给出了采用本发明方法测量到的海水微绿球藻细胞的表面自由能。
[0012]图4给出了采用本发明方法测量到的淡水自养小球藻细胞的表面自由能。
[0013]图5给出了采用本发明方法测量到的淡水异养小球藻细胞的表面自由能。
[0014]图中:
1.放置于不同表面张力液体中的细胞悬浮液，2.离心机离心，3.96孔板，4.光源，
5.光线，6.单个微孔，7.分光光度计。
【具体实施方式】
[0015]下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
[0016]实施例1:采用本方法测量海水小球藻细胞的表面自由能
(1)配置表面张力在2(T50mj m_2之间均匀分布的一系列液体，同时将所配置的溶液按表面张力从小到大依次排列，分别编号；
(2)取10mL海水小球藻细胞悬浮液放入15 mL离心管内，采用0.1 M，PH=7的磷酸缓冲液离心-清洗3次，再将清洗后的细胞再悬浮于新鲜的f/2培养液中。同时将上述10 mL海水小球藻细胞悬浮液浓缩成I mL，并放于1.5 mL离心管内。最后，将再悬浮处理后的细胞悬浮液采用试管搅拌器涡旋搅拌20秒，接着超声震动2 min,以使细胞在液体中均匀分布，并完全分散。
[0017](3)准备若干个1.5 mL的离心管，将所配置的已知表面张力的若干个溶液分别采用移液器移取I mL放于标好号的离心管中；
(4)将5 μ L清洗浓缩后的海水小球藻细胞悬浮液采用移液器注入放有不同表面张力溶液的的1.5 mL离心管内，采用试管搅拌器涡旋搅拌30 s后，将离心管依次放在离心管架上；(5)采用离心机将离心管内的细胞悬浮液离心分离，离心机转速lOOOrpm，离心时间I分钟；分别采用移液器依次移取离心后离心管内上清液体200 μ L，依次注入96孔板；
(6)采用微孔板分光光度计测量96孔板内上清海水小球藻细胞悬浮液的光密度，光密度最高时所对应的液体的表面张力即为海水小球藻细胞的表面自由能，即为35.7 mj π 2。(如图2所示)
实施例2:采用本发明方法测量海水微绿球藻细胞的表面自由能
(1)配置表面张力在3(T60mj m_2之间均勻分布的一系列液体，同时将所配置的溶液按表面张力从小到大依次排列，分别编号；
(2)取10mL海水微绿球藻细胞悬浮液放入15 mL离心管内，采用0.1 M磷
(3)酸缓冲液离心-清洗3次，以将杂质颗粒或细胞碎片等清除，再将清洗后的细胞再悬浮于新鲜的f/2培养液中。同时将上述10 mL海水微绿球藻细胞悬浮液浓缩成I mL，并放于1.5 mL离心管内。最后，将再悬浮处理后的海水微绿球藻细胞悬浮液采用试管搅拌器涡旋搅拌20秒，接着超声震动2 min,以使细胞在液体中均匀分布，并完全分散。
[0018](4)准备若干个1.5 mL的离心管，将所配置的已知表面张力的若干个液体分别采用移液器移取I mL放于标好号的离心管中；
(5)将5μ L清洗浓缩后的海水微绿球藻细胞悬浮液采用移液器注入放有不同表面张力溶液的的1.5 mL离心管内，采用试管搅拌器涡旋搅拌30 s后，将离心管依次放在离心管架上；
(6)采用离心机将离心管内的细胞悬浮液离心分离，离心机转速lOOOrpm，离心时间I分钟；分别采用移液器依次移取离心后离心管内上清液体200 μ L，依次注入96孔板；
(7)采用微孔板分光光度计测量96孔板内上清海水微绿球藻细胞悬浮液的光密度，光密度最高时所对应的液体的表面张力即为海水微绿球藻细胞的表面自由能，即为40.9 mjπ 2。(如图3所示)
实施例3:采用本发明方法测量淡水自养小球藻细胞的表面自由能
(1)配置表面张力在25飞5mj m_2之间均勻分布的一系列液体，同时将所配置的溶液按表面张力从小到大依次排列，分别编号；
(2)取5mL淡水自养小球藻细胞悬浮液放入15 mL离心管内，采用0.1 M磷酸缓冲液离心-清洗3次，以将杂质颗粒或细胞碎片等清除，再将清洗后的细胞再悬浮于新鲜的水生四号培养液中。同时将上述5 mL淡水自养小球藻细胞悬浮液浓缩成I mL,并放于1.5 mL离心管内。最后，将再悬浮处理后的细胞悬浮液采用试管搅拌器涡旋搅拌20秒，接着超声震动2 min,以使细胞在液体中均匀分布，并完全分散。
[0019](3)准备若干个1.5 mL的离心管，将所配置的已知表面张力的若干个溶液分别采用移液器移取I mL放于标好号的离心管中；
(4)将5μ L清洗浓缩后的淡水自养小球藻细`胞悬浮液采用移液器注入放有不同表面张力溶液的的1.5 mL离心管内，采用试管搅拌器涡旋搅拌30 s后，将
(5)离心管依次放在离心管架上；
(6)采用离心机将离心管内的细胞悬浮液离心分离，离心机转速lOOOrpm，离心时间I分钟；分别采用移液器依次移取离心后离心管内上清液体200 μ L，依次注入96孔板；
(7)采用微孔板分光光度计测量96孔板内上清淡水自养细胞悬浮液的光密度，光密度最高时所对应的液体的表面张力即为淡水自养小球藻细胞的表面自由能，即为43.1 mjπ2。(如图4所示)
实施例4:采用本发明方法测量到的淡水异养小球藻细胞的表面自由能
(1)配置表面张力在3(T73mj π2之间均匀分布的一系列液体，同时将所配置的溶液按表面张力从小到大依次排列，分别编号；
(2)取ImL淡水异养小球藻细胞悬浮液放入1.5 mL离心管内，采用0.1 M磷酸缓冲液离心-清洗3次，以将杂质颗粒或细胞碎片等清除，再将清洗后的细胞再悬浮于新鲜的Fitzgerald培养液中。由于异养小球藻细胞的浓度较高，因此细胞悬浮液不需浓缩。最后，将再悬浮处理后的细胞悬浮液采用试管搅拌器涡旋搅拌20秒，接着超声震动2 min,以使细胞在液体中均匀分布，并完全分散。
[0020](3)准备若干个1.5 mL的离心管，将所配置的已知表面张力的若干个溶液分别采用移液器移取I mL放于标好号的离心管中；
(4)将5μ L淡水异养小球藻细胞悬浮液采用移液器注入放有不同表面张力溶液的1.5mL离心管内，采用试管搅拌器涡旋搅拌30 s后，将离心管依次放在离心管架上；
(5)采用离心机将离心管内的细胞悬浮液离心分离，离心机转速lOOOrpm，离心时间I分钟；分别采用移液器依次移取离心后离心管内上清细胞悬浮液200 μ L，依次注入96孔板；
(6)采用微孔板分光光度计测量96孔板内上清淡水异养小球藻细胞悬浮液的光密度，光密度最高时所对应的液体的表面张力即为淡水异养小球藻细胞的表面自由能，即为53.0mj π2。(如图5所示)
【权利要求】
1.一种快速高通量可直接测量细胞表面自由能的方法，其特征在于，该方法可直接且快速高通量的测量细胞的表面自由能，具体包括以下步骤: 配置一系列已知表面张力的溶液，溶液的表面张力范围要涵盖细胞可能的表面能，同时将所配置的溶液按表面张力从小到大依次排列，分别编号； 取5 mL的细胞悬浮液放入15 mL离心管内，采用0.1 Μ, pH=7磷酸缓冲液离心-清洗3次，再将清洗后的细胞再悬浮于新鲜培养液中，并同时把细胞悬浮液浓缩到I mL，放于1.5mL离心管内，最后，将再悬浮处理后的细胞悬浮液采用试管搅拌器涡旋搅拌20秒，接着超声震动2 min,以使细胞在液体中均匀分布，并完全分散； 准备若干个1.5 mL的离心管，将所配置的已知表面张力的若干个溶液分别采用移液器移取I mL放于标好号的离心管中； 将步骤(2)处理后的5 μ L细胞悬浮液采用移液器注入放有不同表面张力溶液的1.5mL离心管内，采用试管搅拌器涡旋搅拌30 s后，将离心管依次放在离心管架上； 采用离心机将离心管内的细胞悬浮液离心分离，取离心后离心管内上清液体，采用移液器依次移取200 μ L，依次注入96孔板； 采用微孔板分光光度计测量96孔板内上清细胞悬浮液的光密度，光密度最高时所对应的液体的表面张力即为细胞的表面自由能。
【文档编号】G01N13/02GK103439228SQ201310418010
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】张欣茹, 姜泽毅, 张欣欣, 左燚, 丑爱辉, 陈亮 申请人:北京科技大学